小中大【求助】酵母原生质体酶解问题
参照同行的实验方案,用zymolyase降解酵母细胞壁制备原生质体时,通过细胞在山梨醇(细胞完整)和SDS(细胞裂解)中的OD600比值来判断是否酶解完成,按方案应该OD比值在5:1甚至20:1的时候表明基本细胞酶解完成,问题是:在我操作的过程中,一直没有出现这么高的比值,在山梨醇和在SDS中细胞的OD值最高不超过3倍,即便延长处理时间到2小时以上都没有这么明显的比值,而且,随着时间的延长,酵母在山梨醇和在SDS中的OD值都在同时下降!
我的问题是:1.为什么随酶处理时间增加,酵母细胞在山梨醇中的OD值也会一直下降?是不是酶解过度细胞已经裂解了?但如果是酶解过度的话,按理说应该能观测到跟SDS处理的OD比值很高(例如方案提供的10-20倍)。
2. 为什么在山梨醇和SDS中均出现OD下降,但比值却一直维持在2:1左右而不增加?是否没有降解细胞壁,而是酶直接导致部分细胞裂解?
反复做了好几遍,还是一样的问题,这样得到的原生质体转化子没有或者最多1个。请大家帮忙看看问题在哪里?谢谢!