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标题:【求助】有关大肠杆菌western bloting...

vtongli[使用道具]
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发表于 2016-2-17 10:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】有关大肠杆菌western bloting...

做了蛋白iptg表达，用考马斯亮蓝染色，可是结果并不明显，我的目的蛋白是26.然后是做wb确定一下，用的半干转，DAB显色，但是我做了两次了还是没有任何条带，之前学妹做的其他蛋白，有条带出来，所以我用的东西应该没有问题。marker有条带，但是好像没有什么背景，也没有用内参，不知道是什么原因？是根本没有诱导出来，还是步骤错了，还是蛋白转过了还是没转上…？有没有懂的帮忙分析一下吧，谢谢，不胜感激～～失落中


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eve_49[使用道具]
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发表于 2016-2-17 10:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先，marker出了条带，那就一定是转上了，26的分子量还是比较小，电泳时间可以再短一点，我是做也是做半干转的，确定一个内参再做还是比较好，你也可以确定一下抗体有没有问题，加一个确定已表达的样品做对照，或者是点一个合成蛋白样品，就是你们做抗体用的蛋白。
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发表于 2016-2-17 10:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的蛋白最靠近marker的那个是空白对照…
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vtongli[使用道具]
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发表于 2016-2-17 10:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 eve_49 于 2016-2-17 10:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
首先，marker出了条带，那就一定是转上了，26的分子量还是比较小，电泳时间可以再短一点，我是做也是做半干转的，确定一个内参再做还是比较好，你也可以确定一下抗体有没有问题，加一个确定已表达的样品做对照，或者是点一个合成蛋白样 ...

好的，谢谢你，我明天再做一次。我学妹的蛋白表达比较高，她也用的一抗1:1000，转45分钟，有条带。我的会不会是表达低所以没有呢？今天又配了一抗1:500打算试试，电转时间应该多少合适呢，蛋白26转了45分钟，marker正反面都有，会不会是转跑啦？
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发表于 2016-2-17 10:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 vtongli 于 2016-2-17 10:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

好的，谢谢你，我明天再做一次。我学妹的蛋白表达比较高，她也用的一抗1:1000，转45分钟，有条带。我的会不会是表达低所以没有呢？今天又配了一抗1:500打算试试，电转时间应该多少合适呢，蛋白26转了45分钟，marker正反面都有，会不会是 ...

你可以在一个泳道点一你学妹的样品，如果她的有条带而你的没有那就是没表达或没表达，marker不知道你用的是什么膜，一般是不会转到反面的
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发表于 2016-2-17 10:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大肠杆菌的蛋白我怎么总是提取不出来啊？做SDS_PAGE总是没有条带。
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 小中大


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原帖由 BUK 于 2016-2-17 10:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
大肠杆菌的蛋白我怎么总是提取不出来啊？做SDS_PAGE总是没有条带。

很好提啊，收菌后直接加2x loading溶解，再煮沸就可以上样了
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BUK[使用道具]
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发表于 2016-2-17 10:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 xevin 于 2016-2-17 10:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

很好提啊，收菌后直接加2x loading溶解，再煮沸就可以上样了

好的，谢谢，再问一下，是煮沸菌体么？
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vtongli[使用道具]
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 小中大
你可以在一个泳道点一你学妹的样品，如果她的有条带而你的没有那就是没表达或没表达，marker不知道你用的是什么膜，一般是不会转到反面的...

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点了学妹的，有条带了，今天才知道我是用错了菌…我们导师在美国，我用的是克隆载体，做了两个月了才发现…呜呜我要哭了。谢谢你了
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vtongli[使用道具]
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 小中大
大肠杆菌的蛋白我怎么总是提取不出来啊？做SDS_PAGE总是没有条带

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你做考马斯亮蓝染色看看有没有高表达条带
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