生物质谱

各位大侠好，
我是外科学的医学生，现在在实验，提的问题很弱智，大家勿拍。
我做目的蛋白的western, 发现其在处理组有明显的分子量漂移，初步推测其为磷酸化改变---因为再同时加了一种激酶的抑制剂后，这种漂移消失了。
但问题是，怎么证明它确实是磷酸化呢？
我查了查文献，目前常用的是放射性P实验和质谱分析什么的，但这对于我们的条件和经费来说，似乎不太可能。
我的问题：
1. 是否可以在用RIPA裂解液提总蛋白时，加入蛋白磷酸酶（大多需要37度孵育？？），然后再western，观察其漂移是否消失？
磷酸酶37度孵育才有用，蛋白酶抑制剂多加些可以吗？
2. 用蛋白质组学里的二维电泳呢？
二维电泳后的胶可以像western那样转膜，显影吗？ 我看到文献里好像都是直接染胶了呀。。。
谢谢大家指点。

你的问题，第一个是否可以在用RIPA裂解液提总蛋白时，加入蛋白磷酸酶（大多需要37度孵育？？），然后再western，观察其漂移是否消失？
这个完全可以，有一篇文献就是体蛋白后加入CIAP处理后，跑电泳，观察迁移速度的。抑制剂确实要多加点。
第二个问题我也不清楚，同问？

其实打一个质谱不需要多少钱的，这种东西最明显的就是质谱了；直接有一个分子量与磷酸基团相等的中性丢失。
2-D我劝你不要尝试，这个你不练上一两个月跑出来的东西基本不能看；可以转膜显影的。

两种方法，如果有你目的蛋白磷酸化的抗体，直接买抗体验证。你的目的蛋白是你裂解细胞前被磷酸化了还是在你裂解过程中磷酸化了，可以在裂解液中加入磷酸化酶抑制剂若要保持目的蛋白的磷酸化状态，要加磷酸酶抑制剂，因其会将目的蛋白去磷酸化，若要保持目的蛋白的去磷酸化状态，可加入EDTA抑制磷酸化。

你的目的蛋白是你裂解细胞前被磷酸化了还是在你裂解过程中磷酸化了，可以在裂解液中加入磷酸化酶抑制剂若要保持目的蛋白的磷酸化状态，要加磷酸酶抑制剂，因其会将目的蛋白去磷酸化，若要保持目的蛋白的去磷酸化状态，可加入EDTA抑制磷酸化"
“可以在裂解液中加入磷酸化酶抑制剂若要保持目的蛋白的磷酸化状态”是笔误吧。。应该是加入磷酸酶吧？  磷酸酶的工作温度都至少是37度，需10-30分钟，裂解时直接加是否能保证磷酸酶正常工作？是否有低温时能正常工作的磷酸酶？

提一个更弱的问题，什么是是分子量漂移？不知道我的理解对不对：你的蛋白分子量是40k，但跑电泳后却在35k左右，这样理解对吗

提一个更弱的问题，什么是是分子量漂移？不知道我的理解对不对：你的蛋白分子量是40k，但跑电泳后却在35k左右，这样理解对吗
对，一般加了磷酸基团，表观分子量可能会变大。
例如我的漂移就是从本来的50K到了55K.

交给CRO公司做就可以了，我知道的APT可以做磷酸化分析的，应该只有几千块大洋……

下次可以试试“引用回复”啊，效果，你懂的！

可以使用磷酸化蛋白凝胶染色试剂盒 BSP043 该试剂盒只对磷酸化蛋白染色，而非磷酸化蛋白不能够染上色
也可以使用蛋白磷酸化水平检测试剂盒    BSP061