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标题:【求助】real-time PCR中内参与目的基因扩增曲线...

langlang[使用道具]
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发表于 2016-3-3 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】real-time PCR中内参与目的基因扩增曲线...

由于实验需要，最近刚刚开始做real－time PCR,以前从没接触过,真是摸着石头过河!好在有咱们DXY,在这里学习到了很多,先要谢谢大家!
我是用SYBR GREEN I对不同样本中的目的基因进行相对定量,使用的机器是ABI7500,选用的是GADPH作为内参基因.
但做的过程中我发现内参基因与目的基因的Ct值相差很远（我们这里姑且称之为起峰时间，这样可能更形象些）。当以RT产物直接作为扩增模板时，目的基因大约在22－23个循环处开始起峰（进入荧光强度的指数增长期），而此时GADPH在5-6个循环就开始起峰了。
由于有朋友跟我说一般要把起峰时间控制在16个循环以后才比较理想，于是我尝试将RT产物进行了50倍稀释作为模板。结果，GADPH的起峰时间推后到了13-14个循环，但目的基因在28-29个循环才起峰（倒是也在扩增结束前到达了平台期），如图。
我想请教各位，应该如何解决内参基因与目的基因的Ct值相差很远的矛盾？到底对于起峰时间需不需要有一个质控标准？控制在什么范围内呢？
我究竟应不应该对RT产物进行稀释呢？
先谢过了！


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发表于 2016-3-3 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
根据你的情况建议如下：
样本一定要稀释，因为在real-time PCR中需要选择一段循环段作为本底校准的，ABI 7500默认值是5~16循环，当然手工也可以改动，但是如果出锋太早，无论如何也不行了，因为仪器的基线校准会不理想。
如果目的基因出峰比较迟，建议在PCR结束后做一下凝胶电泳，确定目的条带，因为在30个循环出峰的，引物二聚体是很容易干扰的，当然通过阴性对照或熔解曲线分析也是可以得出相应结论，但是电泳是最经典的方法。
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发表于 2016-3-3 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
就你所说的上述情况，我认为不应该稀释模版。
目的基因和内参的Ct值相差远没有关系，你可以通过手动调整各自的基线和阈值，把扩增曲线调整到最佳状态，详细地说明你可以参照ABI7500的说明书的40~44页。
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langlang[使用道具]
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发表于 2016-3-3 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我把扩增曲线图补上，大家再帮我看看（上图是以RT产物50倍稀释作为模板）。
另外还有2个问题：
1.
相对定量实验中，最后的分析是不是实际只需对目的基因进行？还需要分析内参基因吗？是不是只需要看看有没有需要忽略的孔即可？
2.
对实验结果进行分析时，我发现自动产生的阈值好像都比较高，不过好像手动下调一些后对实验的最后结果影响也并不是很大。这样的话，是不是一般都不需要手动调整？究竟何时才需要手动设置呢？还有基线的起点和终点，何种情况下需要手动设置？
我将目的基因和内参基因的扩增曲线也贴上来，大家看一下，给提提意见。
目标基因：


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 小中大

内参：


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发表于 2016-3-3 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

没有战友再帮忙分析一下吗？到底模板需不需要稀释呢？
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发表于 2016-3-3 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
目的基因和看家基因起飞时间差很多是正常的，不过如果是5，6个循环就起飞，建议还是稀释一下比较好。
关于相对定量，根据你的问题感觉你还刚接触，应该先看看资料。可以在论坛里面查一下，有很多人提供了资料。
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 小中大

你的基线高是因为你实验体系的本底高，机器为了消除你的本底而需要降前面的杂音，所以整个的基线往上抬。这是其一。
其二，你将cDNA稀释50倍之后，扩增GAPDH得到的ct值与原来的相差10个循环，这是非常矛盾的。可见你原来的5-6个循环就有扩增是不对的，或者说不是真正的扩增曲线。
所以结合两个图标，我认为你的扩增体系还需要优化。
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 小中大
根据你的情况建议如下：
样本一定要稀释，因为在real-time PCR中需要选择一段循环段作为本底校准的，ABI 7500默认值是5~16循环，当然手工也可以改动，但是如果出锋太早，无论如何也不行了，因为仪器的基线校准会不理想。
如果目的基因出峰比较迟，建议在PCR结束后做一下凝胶电泳，确定目的条带，因为在30个循环出峰的，引物二聚体是很容易干扰的，当然通过阴性对照或熔解曲线分析也是可以得出相应结论，但是电泳是最经典的方法。
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 小中大

请教，CDNA的稀释应该用水，还是反转录的buffer.
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