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标题:【求助】甲基化特异性PCR的修饰问题

newway[使用道具]
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发表于 2016-3-3 16:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】甲基化特异性PCR的修饰问题


我做了三周的甲基化特异性PCR了，可用修饰完的DNA做模板，甲基化、非甲基化引物都扩不出来，而野生型引物确能扩出来，引物设计应该没问题，我现在高度怀疑是亚硫酸盐修饰有问题，不知用国产的亚硫酸氢钠和对苯二酚（北京化学试剂公司）可不可以？现在周围没有人能帮我，希望能得到任何做过MSP的人的指点，打电话也可以！急盼赐教！
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发表于 2016-3-3 16:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我都是用Sigma的sodium bisulfide及hydroquinone 修飾我的DNA建議你用的純度高一點或是覺得MSP不好做也可改用COBRA(Comined Bisulfite Restriction Analysis)以bisulfide修飾後PCR amplify 後再以酵素切能切動即是有甲基化(Nucleic Acids Research, 1997, Vol. 25, No. 12 2532–2534)
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ququer787[使用道具]
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发表于 2016-3-3 16:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

野生型引物能扩出条带来，是因为甲基化修饰不完全，修饰后的DNA中有野生型的DNA 。在进行MSP时往往要采用热启动PCR,使双链DNA充分解链，仅其中的一条链作为模板进行扩增。
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发表于 2016-3-3 16:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

先谢谢你， 我正准备换用Sigma的产品,但又觉得同样是分析纯,国产试剂(新买的)应该可以修饰,即使是修饰的不完全,M或U引物也应有条带,我是完全按照Current Protocols in Human Genetics(1998) Herman 提出的方法做的，有用这个方法的同胞吗？是不是这个方法做msp 很难！马上要交课题总结了，急死我了！
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newway[使用道具]
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发表于 2016-3-3 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
刚看到你的留言,同意你的观点“野生型引物能扩出条带来，是因为甲基化修饰不完全，修饰后的DNA中有野生型的DNA 。”如果修饰不完全，至少应该有少量的目的片段被修饰，这样以这些少量的DNA为模板，应该M或U引物也应该有条带呀？难道是我的DNA完全没有被修饰？
我用的是95度预变性5分钟，也是按文献上说的，不知是否可以使双链DNA充分解链？
你做过MSP吗？能否打电话向你请教一下？我真的很着急！
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发表于 2016-3-3 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

实在是劝你改用现成的试剂盒，如chemicon公司的，效果很好，价钱也不算贵，3000左右。可以做几十例呢，我们一直在用，到目前为止已经用到第三盒了。
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newway[使用道具]
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发表于 2016-3-3 16:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用手工修饰的纯化试剂也很贵,要是做不出什么就换试剂,我怕过不了老板这一关呀!我相信别人用这种方法能做出来,我的试验不知是哪个环节出了问题!
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发表于 2016-3-3 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的是chemicon公司试剂盒，可一直做不出来，请教 你的PCR体系是多少？修饰前后DNA量有多少？能否把你的protocol传一份给我，急啊，老板催!
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发表于 2016-3-3 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的问题确实有修饰不完全的因素存在。建议：
1、重新修饰。降低修饰的DNA的量（1-2ug就可以了）；提高修饰的温度，约提高5度左右；也可以增加修饰的时间。当然能用试剂盒就更好了。
2、“如果修饰不完全，至少应该有少量的目的片段被修饰，这样以这些少量的DNA为模板，应该M或U引物也应该有条带呀？” 你所说的这个也很有道理的，所以你可以优化你的PCR，建议提高你的退火温度，延长退火与延伸时间（可以用45s--60s）
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newway[使用道具]
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发表于 2016-3-3 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有个问题不明白，我看到不同的实验室用的亚硫酸氢钠的浓度不同，我是按HERMAN提出的2.6M的终浓度，有人用3.3M，还有用更高浓度的，我用的是国产的试剂，而HERMAN用的是SIGMA的试剂，想请教你1、亚硫酸氢钠、氢氧化钠和醋酸铵的终浓度用多大量合适？
2、醋酸铵的作用是中和反应体系中的碱，还有作为沉淀反应的盐，那么该如何确定其用量呢？
3、氢氧化钠再修饰的过程中用到两次，第一次起变性作用，机理是什么（怎么变性）？第二次是脱磺基作用，反应式是什么？
我想调整我的试验，但又不明白其中的细节，希望做甲基化的朋友能踊跃参加讨论，不知道在哪能找到这方面的知识？请大家给个提示！
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