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标题:【求助】内参的Ct值高于目的基因的Ct值说明什么？

woshi[使用道具]
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发表于 2016-3-3 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】内参的Ct值高于目的基因的Ct值说明什么？


新手做qRT-PCR,迂到困难，请各位战友不吝赐教，不胜感谢！
质粒转染细胞后提取总RNA，反转录得到cDNA做模板，SYBR green法定量PCR，但发现内参（beta-actin)的Ct值高于目的基因的Ct。即目的基因先于内参达到平台期。
看了好多文献，内参都是先于目的基因达到平台期的。我却得到这样的实验结果，是不是哪里出问题了？还是本来就存在这种可能性？这是不是说明模板中目的基因含量比内参含量还高？可不可以认为目的基因在细胞中表达比较高？
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youyou99[使用道具]
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发表于 2016-3-3 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有这种可能的，如果你的目的基因本身的表达量非常高的话，会出现这种情况的。
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woshi[使用道具]
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发表于 2016-3-3 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
但还有些疑惑，为什么没见过别的文献出现这样的情况呢？另外我的这个目的基因蛋白表达（相同的条件转染细胞提取蛋白做WB）却不高。是不是有点矛盾？
有没有可能内参引物有问题（－20放了两年多了）？但已做过普通PCR，扩出的条带很好。
有没有战友的实验出现过这样的结果？
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nn255[使用道具]
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发表于 2016-3-3 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你把cDNA稀释10倍，100倍再作下看看。
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woshituzhu[使用道具]
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 小中大
我用Trizol 法提取的细胞总RNA，有没有可能提总RNA过程中将细胞中的质粒DNA一起提出来？这样的话倒是可以解释目的基因CT值小于内参。
对Trizol提RNA的原理不清楚，还请高手指点，不胜感谢!
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woshituzhu[使用道具]
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发表于 2016-3-3 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
把cDNA稀释10倍，100倍后得到的结果依旧类似：
稀释10倍目的基因CT值：12.679
beta-actin CT值：19.128
稀释100倍目的基因CT值：15.899
beta-actin CT值：22.255
该怎样解释啊？困惑ing....................
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发表于 2016-3-3 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Did you use Dnase to treat the sample?
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woshi[使用道具]
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发表于 2016-3-3 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我没有用DNAase，在园子里搜了一下，发现有的战友提倡用，有的不提倡。
用过的战友可否提供点经验？
1.DNAase(RNAase free)购买哪个公司的产品好？除去DNAase外还要订别的试剂吗？因为在园子里看到还要用人胎盘RNA酶抑制剂，不用可不可以？
2.DNAase处理的具体操作步骤？
3.最后RNA大约会损失多少？
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tuuu2[使用道具]
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发表于 2016-3-3 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我有两个基因的定量也遇到类似情况，但不是所有的样本表达量都高，但计算ΔCt值的时候应该怎么办呢？
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hulu呼噜[使用道具]
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发表于 2016-3-3 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也是这样情况，内参的Ct值高于目的基因的Ct值，是最近做实验遇到的，计算数据怎么办啊。。。好困惑@- @
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