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标题:[求助]关于PCR-SSCP

ero11[使用道具]
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发表于 2011-10-19 15:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]关于PCR-SSCP

[求助]关于PCR-SSCP


我现在要检测一个基因的位点多态性，我初步设计的实验过程：
1.PCR扩增目的片段（片段大小设为350bp，将多态性位点设在扩增片段的中间）
2.1.5%琼脂糖凝胶电泳分离.纯化和回收目的片段（酚抽体法）
3.SSCP检测，将PCR产物样品送检DNA序列
不知道这样可不可行，有什么漏洞或不足之处，还请各位指点和补充。本人不胜感激！！！！
另外我还有几个问题：
1.琼脂糖凝胶电泳回收时胶的厚度.加样孔的大小分别是多少较好？每孔加入的DNA量？
2.做SSCP每孔加样量（所含DNA的量）又是多少？EB染色是不是可行？
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-10-19 15:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、如果PCR扩增的目的片段为比较好的单一带的话，可以直接将PCR产物电泳进行SSCP检测的；
2、如果PCR产物除了目的片段外还有非特异带，可采用琼脂糖电泳、回收的方法，包括酚抽提法和kit法（我们一般用Qiagen的胶回收kit）；
3、我做过半年的用PCR-SSCP检测乳腺癌组织中p53基因点突变，我的做法是将PCR产物直接进行PAGE，然后硝酸银染色，效果非常好，并且结果可长期保存；另外我也看过有人用EB染色的，但它有分辨率低、有毒、结果不易保存等缺点。
4、至于加样量等依你的PCR产量、电泳槽大小等而定，一般有适当量即可。  
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二丫头466[使用道具]
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发表于 2011-10-19 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问一下，是不是将突变的位点设在扩增片段的中间比较好。另外PCR反应体系的体积是不是不需要很大，几微升就够了？
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发表于 2011-10-19 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一般PCR反应体系的体积可以为15微升；
突变的位点在不在中间是没有什么关系的。
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红豆冰[使用道具]
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发表于 2011-10-19 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得还是将突变位点设计在扩增片段中间比较好，因为涉及到测序的问题。
测序时起始的30－50个bp有可能出现误读的问题，是不准确的，所以最好把突变位点设计在距两端引物大于30-50bp的中间部位，这样测序结果更可靠。
另外PCR体系20-100ul都可以，但<50ul的体系更有利于PCR反应，效率更高。推荐20ul或25ul体系，既经济效果又好。
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乌贼老弟[使用道具]
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发表于 2011-10-19 15:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我认为你的片段长度太大了pcr-sscp最好在200-300之间,否则,单链不易分开.  
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Darcy[使用道具]
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发表于 2011-10-19 15:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
PCR后有没有必要通过电泳检测一下产物大概的长度和纯度呀？
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荒漠孤驴[使用道具]
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发表于 2011-10-19 15:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在SSCP检测前的PCR产物的长度和纯度检测非常必要，而且不可省。因为琼脂糖电泳相对简单些，在pcr结果特异，产量可的情况下，才考虑进行SSCP检测，而且经变性处理的样品上样时一定要加入未处理的PCR产物做对照，养成时时做对照的习惯，一旦实验的结果不佳时，就可以作为分析的依据！
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发表于 2011-10-19 15:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问在SSCP检测前的PCR产物的长度和纯度检测时用什么方法较好？我在文献上看到用DNA定量Marker，是怎么回事啊？  
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（cat）[使用道具]
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发表于 2011-10-19 15:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、如果PCR扩增的目的片段为比较好的单一带的话，可以直接将PCR产物电泳进行SSCP检测的；
2、如果PCR产物除了目的片段外还有非特异带，可采用琼脂糖电泳、回收的方法，包括酚抽提法和kit法（我们一般用Qiagen的胶回收kit）；
3、我做过半年的用PCR-SSCP检测乳腺癌组织中p53基因点突变，我的做法是将PCR产物直接进行PAGE，然后硝酸银染色，效果非常好，并且结果可长期保存；另外我也看过有人用EB染色的，但它有分辨率低、有毒、结果不易保存等缺点。
4、至于加样量等依你的PCR产量、电泳槽大小等而定，一般有适当量即可。

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我想问问你的page浓度是多大的，聚丙稀酰胺与双叉的比例、还有是变性还是不变性？
电泳时温度的控制是不是很重要？电泳时间你用的是多少？
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