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标题:[求助]PCR纯化的问题，谢谢！

xyw5[使用道具]
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发表于 2011-10-19 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]PCR纯化的问题，谢谢！

[求助]PCR纯化的问题，谢谢！


我想把PCR产物连接到质粒载体上，有一些PCR纯化的问题想请教大家：
（1）作为PCR模板的质粒和最终要连接的载体有相同的抗性。这时候PCR纯化是不是不能用PCR纯化试剂盒来完成，而必须用切胶的方法？
（2）切胶纯化是必须用低熔点琼脂糖电泳吗？可以用普通的琼脂糖代替吗（这样问是因为经费有限)?
（3）胶回收试剂盒是玻璃珠DNA胶回收试剂盒还是柱式DNA胶回收试剂盒效果好呢？
（4）有没有谁用过生工的DNA分离纯化试剂盒、PCR产物纯化试剂盒 ，效果怎么样（这样问是因为我们这边订生工的东西方便一点）？或者麻烦大家给我推荐一下效果比较好，价格也不太高的DNA分离纯化试剂盒或者PCR产物纯化试剂盒。
接触分子生物学方面试验不久，有很多搞不懂的地方，请大家帮忙，麻烦了，谢谢！
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-10-19 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
回答你的几个问题：
1。PCR回收和你的质粒所带的抗性基因没有关系，可以用PCR纯化试剂盒，也可以用低熔点琼脂糖。
2。普通琼脂糖的熔点很高，切胶后难以熔化，回收效果非常差，最好是用低熔点琼脂糖。方法我想就不用说了吧。可以参考下面的帖子：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=1477242&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#1477242')
3。两种试剂盒效果都很好，但是我觉的柱式方便，而且价钱便宜。我用过赛百胜的PCR回收试剂盒，效果很好，回收条带很亮，50T 120元，够便宜吧。呵呵
祝你实验成功！  
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xyw5[使用道具]
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发表于 2011-10-19 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对于第一个问题我担心的是如果用PCR纯化试剂盒纯化，那么纯化后会有一些模板质粒残留。连接时残留的模板质粒和载体质粒具有相同的抗性，而我连接后转化要通过这个抗性来初步筛选，这样会不会导致有较多的假阳性克隆（其实是模板载体）产生？
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-10-19 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的试剂盒就是以切胶的方式回收，先将PCR产物跑普通琼脂糖凝胶电泳，然后把目的片段切下来，70度加热10min使胶熔化后，用带微型过滤柱的离心管离心过滤，然后再用TE洗涤过滤柱回收PCR产物。
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04906[使用道具]
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发表于 2011-10-19 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的试剂盒就是以切胶的方式回收，先将PCR产物跑普通琼脂糖凝胶电泳，

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你用的是普通琼脂糖？回收效率怎么样？
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-10-19 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
回收效率很好，条带很量，下一步的克隆做的也很顺利。
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鲁西西[使用道具]
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发表于 2011-10-19 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们实验室的PCR产物就是用普通琼脂糖凝胶，反复冻溶法回收的，如果单看电泳条带亮度，回收量还算满意，加保护碱基的产物双酶切后连接载体也还满意，如果不作别的用途，我觉得这样的回收效果还是可以考虑的。
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发表于 2011-10-19 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们实验室的PCR产物就是用普通琼脂糖凝胶，反复冻溶法回收的，如果单看电泳条带亮度，回收量还算满意，加保护碱基的产物双酶切后连接载体也还满意，如果不作别的用途，我觉得这样的回收效果还是可以考虑的。

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你所说的“反复冻溶法”是什么方法，可以告诉我吗，谢谢！
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发表于 2011-10-19 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先：问题1：鉴定的时候可以采用限制性核酸内切酶法，可以很好的鉴定，用抗性筛选在你的这种情况下不能有效去除假阳性（即载体自连）的情况。
问题2：以往我们使用的是普通琼脂糖，回收的效果还不错，可以用于测序。
问题3：我们用回收拄比较多，回收的效率不错。是vioGEN 公司的产品。
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少林弟子[使用道具]
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 小中大
1.使用的是普通琼脂糖回收胶的时候，多少度水浴，水浴多长时间使胶溶化的?
2.你说的vioGEN 是指v-gene公司吗？
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