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标题:[求助]如何根据EB的亮度来给PCR产物定量

#碧海潮生#[使用道具]
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发表于 2011-10-19 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]如何根据EB的亮度来给PCR产物定量

[求助]如何根据EB的亮度来给PCR产物定量


请教大家，电泳条带的亮度，是和碱基数直接相关呢，还是和DNA的拷贝数直接相关呢？
换句话说，是不是说，比较长的pcr产物即使条带很亮，拷贝数也不一定很高；而很短的pcr产物，几十BP的那种，即使条带很淡也有可能拷贝数并不少？
谢谢！
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箭头儿[使用道具]
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发表于 2011-10-19 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
个人觉得 和片段长度不是很大 比方说 我的一个载体双酶切 分别为
500 和1500bp 量上应该是一样的 而肉眼分辨不出亮度上的差别

当能够看出的时候，已相差至少一个数量级。用仪器测，并有相应的公式计算吧  
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发表于 2011-10-19 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
个人认为电泳条带的亮度和片段长度有关，DNA片段长，它所结合的荧光染料就越多
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S6044[使用道具]
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发表于 2011-10-19 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
拷贝数就是摩尔数（mol）吧，我觉得电泳条带的亮度是和DNA的质量（ug）相关的，也就是和DNA的碱基数及摩尔数都有关。DNA越长、拷贝数越多其结合的EB就越多，也就越亮。  
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-10-19 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上同学，在下认为将拷贝数与摩尔数等同起来是不恰当的。
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绿茶公子[使用道具]
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发表于 2011-10-19 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
同意楼上意见，拷贝数和摩尔数是两码事，两个概念
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莲花白[使用道具]
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发表于 2011-10-19 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在下认为：拷贝数是指一条DNA被复制而得到的相同的DNA分子的数目，它所强调的是某一DNA分子的个数。这一点本质上与摩尔是相同的，但是就DNA这一大分子物质而言，研究它时更关心的是具体有几个分子，换句话说就是相同分子的数目究竟是多少，显然这一概念在应用时比起摩尔更加具体，分子数目也更小一些。  
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莓菓333[使用道具]
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发表于 2011-10-19 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
另外，溴化乙锭作为一种碱基类似物，是按照一定比例插入DNA片断当中的，无论被染色片断的长度是多少，EB插入的频率是一定的，平均每隔几个碱基就可以插入一个。所以除非DNA片断会短到只有几个碱基，一般情况下对于整个DNA分子集合而言，EB的结合量是成一定比例的。
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桔囿[使用道具]
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发表于 2011-10-19 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
当然就单条DNA分子而言，片断越长肯定结合的EB量就越多，这是毫无疑问的，但是对于大量的DNA分子集合而言，结合的EB量就与DNA的总量有关了。
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喵咪[使用道具]
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发表于 2011-10-19 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对于PCR产物通常都是扩增得到的大量相同DNA分子，所以最终亮度一方面与每条DNA的长度有关，另一方面也与扩增的总量有关。不妨用模板的长度乘以各自的PCR循环数，倒可以得出一个值得参考的值，当然要保证PCR顺利进行。
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