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标题:[求助]请教mRNA电泳结果

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发表于 2011-10-19 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]请教mRNA电泳结果

[求助]请教mRNA电泳结果


我的mRNA电泳结果，加样孔里的是蛋白还是DNA污染，mRNA的条带还好吗？总RNA的OD值都在2.0左右，但mRNA的OD260/OD280为2.1左右，是不是有问题？麻烦大家帮我看看。


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2011-10-19 16:32
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发表于 2011-10-19 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很明显，加样孔里面是DNA污染
你是用什么方法提的mRNA?
如果是总RNA，其结果似乎不太好，因为rRNA不清晰。
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发表于 2011-10-19 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的是invitrogen的TRIZol提取的总RNA，然后用clontech公司的Nuclotrap mRNA Purification Kit提的mRNA，电泳是1％的普通琼脂糖，用DEPC水处理过，只是不知道跑的结果如何，除外DNA污染的化，mRNA提取有问题吗？
多谢biohu82的帮助。
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发表于 2011-10-19 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也在用这一套东西提取和纯化mRNA，显然你的mRNA电泳图不对劲。因为mRNA没有这么大的片段，和大片断这么高的亮度。（不过你的mRNA的产量倒是很高啊。请问你的RNA是多少量去纯化mRNA的？）
你提取RNA时没有进行电泳吗？要是有DNA污染，那时候就可以很明显的看出来呀。
另外marker的大小呢？mRNA有一个大小范围的。  
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发表于 2011-10-19 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是用大概250ug的总RNA纯化mRNA的，提的总RNA没有电泳，只是测了OD值，我也怀疑是DNA污染，但我每次上清吸得也不是很多，不知为什么？我用的是DNA marker，DL2000，mRNA的大小范围是600～5kd吗，不知对否？我的mRNA在这个范围吗？
而且因为我最后所需的mRNA浓度要求比较高，洗脱mRNA用的去RNA酶水我没有按照要求来，而是减少了。不知道这样行否？
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发表于 2011-10-19 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是用大概250ug的总RNA纯化mRNA的，提的总RNA没有电泳，只是测了OD值，我也怀疑是DNA污染，但我每次上清吸得也不是很多，不知为什么？我用的是DNA marker，DL2000，mRNA的大小范围是600～5kd吗，不知对否？我的mRNA在这个范围吗？
而且因为我最后所需的mRNA浓度要求比较高，洗脱mRNA用的去RNA酶水我没有按照要求来，而是减少了。不知道这样行否？
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发表于 2011-10-19 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
mRNA应该在2 kb左右的亮度最大，延伸到10kb左右的吧。

应该跑个RNA电泳，这样可以看看RNA的纯度和完整性，以决定下一步实验的做法。

另外抽提RNA时，上清的吸取当不当跟DNA应该没有多少关系，更多关系到蛋白污染的问题。DNA污染是不是在加入Trizol，在室温放置这个阶段，和离心力这两个阶段有关？

另外换个大一点范围的marker吧。这样便于看看你mRNA的范围。

我在做SSH，mRNA的浓度也要求高，我也是减少洗脱的水量。应该是没有问题的，就是mRNA的产量可能会比较低。呵呵，我的产量没有你的高，对了，我用的是QIAGEN的mRNA纯化试剂盒。
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发表于 2011-10-19 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
真是太好了，我也在做SSH，以后我们真是应该多交流啊！
请问tengwan现在做到那一步，我现在就是在mRNA提纯这一步给难住了，今天我又抽提了一次，最后洗脱的水减少到20ul，可是没想到电泳可以见到清楚的28s和18s条带，好郁闷啊。
每次我都是用十几管混合抽提mRNA，就只测一下OD值，没有跑电泳（电泳麻烦）。
tengwan你用的是TRIzol提总RNA吗，QIAGEN的mRNA纯化试剂盒效果如何？
想请教你是怎么做的，现在我觉得提纯mRNA真是难，要达到高浓度更难。
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发表于 2011-10-19 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用过国产的TRIZol提RNA,DNA带很明显，但用invitrogen的TRIZol提取总RNA，电泳看不见DNA带。你的mRNA中DNA很多，说明总RNA提得不够好，有大量DNA污染，可能是TRIZol和起始材料的比例不对，TRIZol不够而材料比较多。以含大量DNA的mRNA起始做SSH恐怕后面很麻烦。第一步总RNA质量要好。
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发表于 2011-10-19 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也只是往前走了几步。
对，也是用invitrogen的TRIZol提取的RNA。
还是应该检测一下总RNA的完整性，因为OD值不能反应是否有DNA污染，或者你的RNA是否已经降解了。再说，OD值的可靠性不是很大，比值与你的溶剂的离子、PH值、温度等因素有关，OD值一般我只是拿来做一下参考，并不以它为准。
所以，提取后跑个总RNA琼脂糖电泳是很必要。
要是嫌配制变性的RNA电泳胶麻烦，可以跑个普通的琼脂糖电泳，把所有用具稍为处理干净点就好。

另外，如果有大的离心机，你可以用50 ml的离心管大量抽提RNA，这样操作就会比较简单一些。

只要总RNA的纯度好，完整性好，mRNA的分离很简单的。这个从试剂盒的说明书也可以看出来。

另问：clontech公司的Nuclotrap mRNA Purification Kit分离mRNA的原理是什么？为什么你的mRNA有这么多的DNA污染？
呵呵，我希望知道。  
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