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标题:[求助]我的总RNA提取到底出了什么问题?

9900[使用道具]
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[求助]我的总RNA提取到底出了什么问题?

[求助]我的总RNA提取到底出了什么问题?


玻璃器具、研钵处理方法:
洗洁精洗后自来水冲7遍,双蒸水冲3次,60℃烤干,泡酸过夜后自来水冲7遍,双蒸水冲3次。烤干,150℃烤4小时。
枪头、EP管等处理方法:
0.1%DEPC溶液浸泡过夜,取出高压灭活DEPC 15分钟。
实验用水:
均用0.02%DEPC处理水配制。0.02%DEPC处理水配制方法:配0.02%DEPC水溶液,15Psi高压15分钟。
组织处理:迅速取出称取100mg,放入1.5 ml EP管中(未处理),置-70℃保存。
提取方法:
1.  将组织取出,在-20℃预冷的研钵中冰浴研碎,1mlTRIZOL将组织冲洗入DEPC处理1.5mlEP管中,室温5分钟。或直接将1mlTRIZOL加入预冷玻璃匀浆器中,冰浴中匀浆后将匀浆液转到EP管。
2.  加0.2ml 氯仿,用力摇15秒后,室温3分钟。
3.  12000g 室温离心10分钟。
4.  将水样层转移到另一干净EP管中。
5.  加0.5ml 异丙醇,室温10分钟。
6.  12000g 室温离心10分钟,倾去上清,加1ml 75% 乙醇。
7.  7500 g离心5分钟,吸去上清,自然干燥10分钟。
8.  加40微升DEPC处理水溶解。
9.  58℃温育10分钟促其溶解。
10.  取10微升,溶于2ml TE 缓冲液中,以TE为空白对照,测A260/A280。通常测出A260/A280为1,有时更小。
11.  取8微升,加2微升上样缓冲液,于1.5% 琼脂糖凝胶中 150V 电泳10分钟至半小时(1*TBE电泳缓冲液)。结果只可见5S带。

因为不成功,所以我重新处理了实验用器具并重新配制了所有试剂,(氯仿和异丙醇没有重新处理).但情况还是一样.
因为取出组织我没有经过液氮速冻,而是直接放在-70度冰箱中,我想是不是样品保存条件不好,所以我又将新鲜组织取出后立即置于TRIZOL中匀浆,结果和以前一样.
于是我怀疑是不是TRIZOL有问题,在医院检验科要了一个小包装的丙肝RT-PCR试剂盒的单相裂解液重复了一次,还是不成功.仍是只见5S带.
现在我真的是想不出来还有什么问题了 .
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#甜#[使用道具]
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取出组织后,如果不是马上提取的话,最好置液氮速冻后在放-70度冰箱保存。粉碎组织时,最好用液氮速冻,用研棒研细,此过程中不断添加液氮,然后转移至1.5ml离心管中。
另外一点,我用的电泳工作液都是0.5*TBE哦。  
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9900[使用道具]
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我改成05*TBE
还是不行呀
而且这应该与最后电泳关系不大吧
无非是电泳时间要长一些
RNA降解得多一些而已
现在是干干净净的就一条带
那么应该不是在电泳时降解的吧
短短10分钟不会降解得这么干净吧
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喵咪[使用道具]
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就单说你的步骤吧:
1、自来水冲7遍,双蒸水冲3次(自来水至少冲十几遍,我们是)
2、150℃烤4小时(180度四小时,甚至过夜)
3、配0.02%DEPC水溶液,15Psi高压15分钟(1%DEPC水溶液,37度过夜,高压蒸汽灭活)
4、所有操作,除了加上trizol后的室温孵育,尽量在冰上进行,不用每步都等,尤其你又不是4度下离心
5、冰浴中匀浆(用枪头吹打就行,好像太“碎”也不好)
6、加0.2ml 氯仿(可以192ul氯仿+8ul异戊醇)
7、我们电泳时用1×TAE、1%凝胶,100v,20分钟

仅供参考哦
*^-^*
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nut6694[使用道具]
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看步骤没有什么问题,按说RNA的提取也没有这么难,我最初提取的时候步骤还没有这么严格,所有的操作都在室温(包括组织的处理都是),组织也没有经过液氮,-70度保存的,提取的RNA做RT-PCR是没有问题的。

能不能找人帮忙,换换手,也许老是一个人摸索,陷入了误区自己发现不了呢。

说几点可能:
1.组织的研磨不要太过,我当初提取DNA的时候,就是因为处理的太过,导致得率很低。
2.如果只是检测表达用,不妨先用引物扩增一下试试看。如果RNA的量很少,电泳不一定能
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nut6694[使用道具]
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看步骤没有什么问题,按说RNA的提取也没有这么难,我最初提取的时候步骤还没有这么严格,所有的操作都在室温(包括组织的处理都是),组织也没有经过液氮,-70度保存的,提取的RNA做RT-PCR是没有问题的。

能不能找人帮忙,换换手,也许老是一个人摸索,陷入了误区自己发现不了呢。

说几点可能:
1.组织的研磨不要太过,我当初提取DNA的时候,就是因为处理的太过,导致得率很低。
2.如果只是检测表达用,不妨先用引物扩增一下试试看。如果RNA的量很少,电泳不一定能看出来;OD值测定,10ul+2ml体积比太大,误差太大,测的不一定准确。如果一定要测,尽量用需样品少的比色杯(50ul),稀释误差小多了。看不到不等于没有!
3.加氯仿后,如果有振荡器,最好是振荡,分离效果好。没有的话,用力摇是怎么摇的?可以找个空的盛TIP头的盒子,EP管盖紧了,用盒子晃效果也可以。
4.溶解的时候,不用水浴也可以,或者37度,尽可能减少损失。
5.加异丙醇后,可以放在-70度1h,或者过夜,然后再离心,可以提高RNA的得率。

现在只能想到这么多了,祝好运!
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9900[使用道具]
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就单说你的步骤吧:
1、自来水冲7遍,双蒸水冲3次(自来水至少冲十几遍,我们是)
2、150℃烤4小时(180度四小时,甚至过夜)
3、配0.02%DEPC水溶液,15Psi高压15分钟(1%DEPC水溶液,37度过夜,高压蒸汽灭活)
4、所有操作,除了加上trizol后的室温孵育,尽量在冰上进行,不用每步都等,尤其你又不是4度下离心
5、冰浴中匀浆(用枪头吹打就行,好像太“碎”也不好)
6、加0.2ml 氯仿(可以192ul氯仿+8ul异戊醇)
7、我们电泳时用1×TAE、1%凝胶,100v,20分钟

仅供参考哦
*^-^*

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谢谢你的解答。你的条件真的很严格哟,不过后来我已经改为180度10小时,另处用枪头吹打是提细胞吧,组织不匀浆的话不行吧。
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嘉年华[使用道具]
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我们提取RNA时候研磨组织的时候都是在液氮条件下进行的!
另外,如果组织中RNA含量低的时候,加多了Trizol反而提不出来,经验,原因不明!  
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wawa[使用道具]
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其实有时候并不完全是步骤本身的问题,知道吗?也可能是提取过程人为的因素,所以我感觉应该全方位的考虑,可能对查找其基本原因意义更大一些,同意楼上的观点,建议研磨组织样的时候在液氮中进行,并且注意在研磨中放组织样前一定要用液氮预冷一下,可能会更好一些,研磨过后转移到1.5ml的离心管中时的转移器具也要预冷一下,我感觉应该多注意一些比较细节上的问题,可能对你提取有很大的帮助,试试看吧!祝你好运  
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韩梅梅[使用道具]
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第九步不要!  
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