小中大建议楼主进行降落（TD）-PCR，并摸索一个最佳的PCR退火温度，这对高GC含量基因扩增是至关重要的。以下是我一篇文章中关于扩增高含量GC的基因的总结，也可看一下，希望对你有所帮助。
引物GC含量分别高达70%以上时，用普通PCR很难理想地扩增出此基因。因为G、C之间形成三对氢键，解链所需能量较高，故模板较难打开，在常规变性温度下，DNA模板变性不完全，同时由于单链的G＋C丰富区易于自身互补配对形成稳定的发夹环二级结构，而使PCR引物难于结合到模板上，DNA聚合酶也难于延伸或停止延伸，结果常出现严重的非特异性条带，甚至扩增不出靶基因。
在扩增高含量GC的基因时，可对PCR条件进行几个方面的优化：
1、热启动（hot start）PCR：使用热启动PCR，一方面通过扩增前的加热，使双链模板充分解链，另一方面，通过高温启动反应，促进引物的特异性复性与延伸；增加有效引物的长度，提高了反应的特异性与灵敏性，并减少了引物二聚体或多聚体的形成，从而能提高GC富集区的扩增效率。我们采用Qiagen公司提供的Hotstar Taq DNA聚合酶，此酶含有一种热不稳定性保护抗体（ Taqstart antibody），该抗体在低温时与Taq酶结合，抑制其活性，当反应体系达到一定的温度后，这种热不稳定性保护抗体就从Taq酶上脱落下来，Taq酶得以恢复活性。我们在PCR开始时就加入Hotstar Taq DNA聚合酶，并延长起始变性时间如95℃变性15 min，能使模板DNA完全变性，以便提供最大数量的引物配对位点，避免了引物二聚体和非特异性配对。
2、降落（TD）-PCR：PCR开始时的退火温度高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值并最终低于这个水平。退火温度选择应根据引物的长度及G+C的含量，在Tm值允许的范围内，较高的退火温度可大大减少引物和模板的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。首先在高于引物Tm值的温度扩增几个循环，然后把退火温度逐渐降到两引物的Tm值附近，在随后的循环中，对退火温度进行梯度实验。这样能保证第一引物-模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何级扩增，在剩下的循环中处于超过任何非特异PCR产物的地位。因此，TD-PCR既能增加反应特异性，又能提高PCR产物的产量。
3、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、模板等也影响PCR的产量及产物特异性。它们的浓度过高反应特异性降低，过低则PCR产物产量减少，即高特异的反应条件可能与高产量的反应条件并不一致。
