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标题:【求助】我想重组个含有磷酸化位点的蛋白

wawa11[使用道具]
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发表于 2016-3-11 13:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】我想重组个含有磷酸化位点的蛋白

如题，我想重组个含有磷酸化位点的蛋白，然后检测下这个蛋白能否被磷酸化；
如果可以的话有没有什么方法能够确定一下蛋白的磷酸化位点.
请大家多多指教、探讨！
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xiaoxiaoai[使用道具]
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发表于 2016-3-11 13:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

试用一下PhosTag SDSPAGE，如果运气好，磷酸化的蛋白质和未磷酸化的（用碱性磷酸化酶处理一下）同时跑胶，看看是否有明显差异。我检测过单个磷酸化位点的蛋白质，分离的很好，很容易就区别出来了。也有蛋白质无法分离的。
测定磷酸化位点，如果有条件可以用质谱分析，分离到磷酸化肽测序。如果上述PhosTag方法可行，突变最可能的磷酸化位点，检验是否点突变消除了磷酸化，这是一个苯方法。
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mimima[使用道具]
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发表于 2016-3-11 13:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

SDS－PAGE 可以尝试diamond Q染色磷酸化蛋白质。
或用碱性磷酸化酶处理你的样品释放磷酸离子，用Malachite Green 测定是否有磷酸离子从蛋白质释放出来，如果有，说明你的蛋白质有磷酸化。但位点测定还是用质谱分析最好。
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大嘴猴[使用道具]
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发表于 2016-3-11 13:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

用什么蛋白激酶，决定于你的磷酸化位点。如果是PKA，最好用PKA复合体，而不是PKA催化亚基，因为复合体稳定容易保存。
如果用质谱分析，只要带磷酸化位点的肽能否电离并被测序，磷酸化位点就可以被测定。不过测定磷酸化位点还是有点挑战性和需要运气。
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PP熊[使用道具]
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发表于 2016-3-11 13:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

将磷酸化的蛋白跑SDS-PAG，取目的条带，然后进行质谱鉴定，通过多级质谱解析蛋白的磷酸化位点的具体位置
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女儿情[使用道具]
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发表于 2016-3-11 13:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

1、WB检测磷酸化蛋白时必须要加入磷酸酶抑制剂吗？
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女儿情[使用道具]
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发表于 2016-3-11 13:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

我们都用美国G-BIOSCIENCES的FOCUS™ PhosphoRich™  786-255
提取磷酸化蛋白，比较纯净。
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8899[使用道具]
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发表于 2016-3-11 13:08 资料  个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

WB检测磷酸化蛋白时的蛋白上样量一般为多少？
3、WB检测磷酸化蛋白时的蛋白提取过程，一般直接加入裂解液到培养板上嘛？还是先收集再加入裂解液（贴壁细胞）？
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xgy412[使用道具]
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发表于 2016-3-11 13:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

最近做蛋白的磷酸化检测，总是检测不到，非磷酸化的及内参可以检测到，比如探测CDC25的磷酸化，一般处理后多长时间提取蛋白？
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yayayu[使用道具]
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发表于 2016-3-11 13:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

要加磷酸酶抑制剂；
蛋白一般在40-50微克每孔吧；
两种方法都可以，第二种可以浓缩一下蛋白。
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