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标题:[求助]我的RT-PCR最近怎么老是做不出来,郁闷之极啊

长发piaopiao[使用道具]
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发表于 2011-10-20 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]我的RT-PCR最近怎么老是做不出来,郁闷之极啊

[求助]我的RT-PCR最近怎么老是做不出来,郁闷之极啊


我是从细胞培养的病毒里用TRIZOL提取RNA的(病毒的毒力较弱,滴度不高),RT-PCR后电泳什么条带也没有(有二聚体),将PCR产物做摸板(1:100稀释)再扩却产生了很长的拖尾.但是同样的方法,体系和试剂,另一个强毒(阳性对照)却能扩的很好.是不是病毒含量少的原因啊?很郁闷,大家帮忙分析一下原因吧
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-10-20 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的RNA有没有检过样！
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-10-20 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很可能是病毒含量过低，增加模板量试试吧。  
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发表于 2011-10-20 15:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可能是你的模板量不够,或逆转录过程得到的cDNA量太少或转录效率较低
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zhezhe[使用道具]
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发表于 2011-10-20 15:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
同时做了内参吗？如果内参有说明不是模板少  
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发表于 2011-10-20 15:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢各位,很可能就是病毒少摸板少的原因,因为只进行一次PCR虽没有条带,但用内参以PCR产物为摸板就可出现条带.同样以PCR产物为摸板,重新进行原来的PCR过程怎么就出现了弥散状的大拖尾,越往加样空就越亮,不知道是什么原因,想要的目的片段怎么也出 不来.PCR不是很灵敏的吗?PCR对cDNA的拷贝数的最低要求有多少啊?从病毒里抽提RNA,哪个公司的kit好用啊?  
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发表于 2011-10-20 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用PCR产物作模板重新PCR有时会有这种情况出现，是非特异扩增，建议再设计一对nest引物。我用过qiagen的kit，感觉不错。
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发表于 2011-10-20 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我本来是想拿到一段完整的基因的,如果再设计nest引物,那基因就不完整了.不过,如果实在不行的话也就只好这样了.
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发表于 2011-10-20 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对于你的问题我也遇到过，我的经验是这样：如果在第一次扩增时看不到目的条带，同时也几乎没有非特异扩增，再作第二次PCR时有的可以扩出来，我认为这种情况可能源于模板量极低，也可以用提高PCR产量的扩增手段：首先，Ta-（5-8度）扩10-20cycle;然后，Ta扩20-30cycle.但是如果在第一次扩增时看不到目的条带，同时有非特异扩增（目的条带处出现了一些东西，模糊不清晰），再作第二次PCR就肯定是一片极亮的smear，这时可以做touchdown，原因主要是退火温度不是最佳，而touchdown可以保证特异条带以较高的产量被扩增，在PCR条件尚未优化时是较好的选择。  
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发表于 2011-10-20 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那就设计一对外围引物
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