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标题:[求助]产物能否进行二次扩增，怎样进行

remenb[使用道具]
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发表于 2011-10-20 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]产物能否进行二次扩增，怎样进行

[求助]产物能否进行二次扩增，怎样进行


我用石蜡包埋组织做为PCR模板，扩出的条带弱，不能进行TA克隆，如何使其强一些？使用产物再 进行PCR可以吗？
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丁香@@[使用道具]
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发表于 2011-10-20 16:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
当然可以啊，你想ＰＣＲ的原理就知道了，用产物作为模板从另外一个角度看其实就是将ＰＣＲ又多进行了几十个cycle！！！
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remenb[使用道具]
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发表于 2011-10-20 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
好象实际做起来不是这么简单。
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2011-10-20 16:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
....跑次胶(聚丙烯酰胺或琼脂糖都可),分离切割所需条带,回收后再做PCR即可....
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楚留臭[使用道具]
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发表于 2011-10-20 16:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
回收损失比较大，如果产物本身就条带弱，可以用它直接二次PCR，模板的量要根据产物的浓度来定，如果很弱，50ul体系可直接加1ul产物，如果有些亮，可稀释5、10、50、100等倍数来做，一次稀释几个浓度，这样可以得到到最佳的效果。  
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duoduo[使用道具]
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发表于 2011-10-20 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
二次扩增需要稀释模板,你可以做个稀释剃度试试,就像楼上说的,稀释50、
100、200等，最好以稀释100倍为中心，上下浮动摸索一下了  
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remenb[使用道具]
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发表于 2011-10-20 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
事实证明直接用产物进行PCR 不行，有几条杂带，问了同实验实的人也说是这种结果，考虑是非特异扩增第二次被放大所致。下一步我将切胶进行纯化，再以产物行PCR，结果待报。
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发表于 2011-10-20 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也用PCR产物做过二次扩增，将产物稀释了100，1000倍，但结果不好，不知怎么搞的，老是出现弥散状拖尾，越靠近加样孔就越亮，这是怎么回事啊？ 还有啊，如果我第一次PCR没有出现目的条带，或者条带拖尾，还可以用产物进行二次扩增吗？我做过，好象不好。有没有人做过啊？传授一下经验吧
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森林木[使用道具]
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发表于 2011-10-20 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果有目的条带出现，电泳切胶后不需要纯化，加几十ul水，把胶捣碎，吸取1ul作模板重新PCR就可以了。我做过许多次这种方法，很有效。
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跳跳糖[使用道具]
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发表于 2011-10-20 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用PCR产物在做PCR,一定要用高保真酶,否则突变几率大增
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