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标题:[求助]反义掉一个家族还是一个？

刘白白[使用道具]
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发表于 2011-10-20 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]反义掉一个家族还是一个？

[求助]反义掉一个家族还是一个？


本人所在课题组利用western blot方法发现某基因编码蛋白与hsp70蛋白表达谱极度相似，故拟用antisense RNA方法构建hsp70蛋白缺陷细胞株以进一步研究某基因的功能（本实验室RNAi方法正在构建中，目前效果不太理想）。故想请教大家，我们应该设计hsp70s的兼并引物，反义掉hsp70s呢，还是应该针对hsp70家族中的某一个或某一类基因 ？
（注：已经查过产品说明书，一抗anti-hsp70乃混合抗体！）
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冰激凌小姐[使用道具]
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发表于 2011-10-20 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还是针对一个家族吧，一般一个家族的成员在功能上是冗余的吧

建议比对所有家族成员，选出与你的基因相似性最高的成员，根据相似部分序列设计  
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刘白白[使用道具]
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发表于 2011-10-20 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
但是我们知道hsp70s在热休克蛋白中是最重要的一个家族，如果现在针对整个hsp70家族设计兼并引物，使整个家族蛋白的表达量下降到百分之四十到七十以上，那么很可能使细胞难以生存，细胞都难以生存了，如何还能有余裕供我研究我们基因的功能呢？

blast所有家族成员，然后找出相似性（同源性）最高的？我们原先也有这个想法，但最大的问题是我们比对了一半发现难以比对下去了，因为有好几个基因相似值是完全一样的，怎么判断其中哪一个是更好的呢？即使相似值较低的其他成员我们也不敢贸然肯定一定与我们的基因没关系。因为基因与基因之间的相互作用机制太复杂了～～～～～～～～
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发表于 2011-10-20 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是做植物的，所以不是很清楚你们实验设计

我可以就我们的实验给你提一点建议：
有的基因，纯合突变体会致死。研究这类基因可以使用特殊的植物载体，比如使用特定组织表达的启动子、受诱导的启动子等等；还有一般的RNAi技术可以得到不同的转化体，可以对RNA有不同程度的抑制，产生不同程度的knockdown转化体。  
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-10-20 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有一点不太明白，你要研究感兴趣的基因，那么你为何不直接抑制你那个感兴趣基因的表达而去抑制hsp70蛋白呢？？？我感觉你们这个课题思路可能有点问题，首先，你们想弄一个hsp70蛋白缺陷的细胞洙，为什么这样做？？？这样的目的是干什么？？？就事论事，你们的这个技术策略就达不到你们的目的，不管是RNAi和anti－sense我们知道都是knockdown的，而且就你所说的这个目的，那当然是要将这个家族的基因都给沉默调了，想象看，这个工作量有多大？？？
其次，看了半天，终于领会了一点你的意思，你们是不是说在你们的前期试验中搞到一个基因跟hsp70蛋白具有一些同源性，但有不是目前肯定的hsp70蛋白的成员，是这个意思吗？？？如果是我们接着切磋。
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刘白白[使用道具]
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发表于 2011-10-20 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们的一抗是美国SANTA CRUZ公司的HSP 70 (W27): sc-24。在做western blot的时候，发现我们的基因在对毒物反应、氧化应激以及热休克反应中，与hsp70同步表达，两者表达曲线极度相似。故而，决定接着做RT-PCR，看看两者在mRNA的水平上是否也表达一致。再做hsp70基因的knock down，看看我们的基因是否参与hsp70的信号通路。问题就是怎么设计RT引物？以及怎么做ashsp70？

一抗中关于其特异性的描述如下：HSP 70 （W27）reacts with both HSP70 and HSC70 of mouse,rat and human origin by Western blotting,innunoprecipitation and innunohitochemistry;recommended for staining of both frozen and formalinfixed,paraffin-embedded tissue sections.

从以上特异性可以看出来，该抗体不仅能检测出结构性的hsp70也能检测出分泌性的hsp70，乃一混合性抗体。所以我不能清楚到底是应该做整个家族，还是慢慢实验，逐一用更特异的hsp70单克隆抗体来做western？

查阅相关文献，看到有做整个家族的，更多的是分开来做的。做整个家族怕太影响功能做不下去，做其中的某一个基因又怕南辕北辙、不得要领，更何况这个家族各个大大小小的基因有几十个，实在有如大海捞针，工作量太大了。所以就在犹豫之中。
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 小中大
还有一点，忘了说了，我们基因的antisense RNA技术平台也正在构建之中，由于是单基因，不存在家族性的问题，所以做起来比较顺利。

但是我们知道，研究基因与基因之间的相互作用与关系，有时是需要2*2＝4来设计的。正常观察、分开knock down 2个、同时knock down。这四个水平都会涉及很多复杂的东西。所以hsp70的knock down看来也非做不可了。

有时不仅仅是技术的问题，实验设计以及遇到问题时应对的思路才是最难最关键的，唉！～～～～～～～～
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发表于 2011-10-20 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
其实HSP70家族的很多成员其序列是类似的，其功能也是类似的，实际工作中往往很难将其分开，也没有必要将其分开。而同样一个基因，在不同物种的名称也可能不同。我找到了一篇有关人类HSP70家族的文章，但我不知如何贴上来。请告诉我你的邮箱，我可以发给你。
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刘白白[使用道具]
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发表于 2011-10-20 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
终于决定反义抑制掉整个hsp70家族的基因了。唉，剩下的问题就是找它们的保守序列，然后设计引物了～～～～～
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冰激凌小姐[使用道具]
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发表于 2011-10-20 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有一点疑问，你的基因是hsp70家族的成员么？
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