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标题:【求助】最近细胞受支原体污染,实验室在寻找解决办法

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【求助】最近细胞受支原体污染,实验室在寻找解决办法

刚开始并没有在意,可是污染越来越严重,所有人的实验都进行不下去了,不得已,打算先甲醛和高锰酸钾熏蒸(用量:甲醛40%浓度加10ml /立方米,高锰酸钾5g/立方米),熏蒸完毕之后再将细胞加抗支原体药的培养基培养,抗支原体药还没决定买哪家的。
大家有什么好的建议,希望赐教。
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2
 
Q: 支原体污染对细胞有什么危害?

A: 支原体污染后,不会使细胞死亡可以与细胞长期共存,培养基一般不发生浑浊,细 胞无明显变化,外观上给人以正常感觉,实则细胞收到多方面潜在影响,如引起细胞变形, 影响 DNA 合成,抑制细胞生长等,以致影响实验数据的可信度。
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Q: 支原体污染有什么特征?

A: 细胞状态变差,生长变慢,在显微镜下观察可能会有小黑点,但培养基一般不发生 浑浊。细胞传代以后就出现细胞间黑点,细胞空泡化,很多类似凋亡、坏死的细胞,最终细胞漂浮,完全死亡。具体特征请见附件 2。
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Q: 细胞培养时,显微镜下的小黑点是什么?

A: 支原体污染后,细胞凋亡坏死,释放出大量碎片,看起来就像小黑虫子。
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5
 
Q: 细胞通过何种途径感染支原体?

A: 支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染(某些支原体在人体是正常菌群如口腔中的支原体)、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染等等,由于支原体大小为 0.1~0.8 um,无细 胞壁,可透过一般过滤膜(0.22-0.45 um),血清中也可能含有支原体。
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6
 
Q: 支原体污染如何检测?

A: 利用支原体具特殊专一性之 primers,经由 PCR 反应来复制支原体 DNA。所用 primers 来自支原体的 conserved 16S-23S rRNA 序列,由于此段序列依支原体种类不同而不同, 因此可依所复制之 DNA大小及其 restriction fragment 大小差异来作侦测与鉴定支原体。
(具体方法见附件)。
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7
 
Q: 如何清除支原体?

A: 由于市场同类产品都为抗生素类,对细胞本身也会产生一定影响,而且有反复发 作的风险,吉锐生物推出的 MycoplasmaOUT?Treatment,活性成分为抗菌肽,经多方测试表明对大部分细胞无毒害作用,因其独特的作用原理,支原体不会对其产生耐药性,并且其作用时间短,在三天内就可杀灭支原体,并自动降解成氨基酸,不会对细胞造成二次污染。
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8
 
Q: 为什么在培养细胞前要加入MycoplasmaOUT? Prevention?

A:由于支原体污染后能够进入细胞,而MycoplasmaOUT? Prevention不能够进入细胞内也就不能杀灭已经进入细胞的支原体,而这部分细胞死亡时会释放其内部的支原体,需要MycoplasmaOUT?Prevention来杀灭新释放出的支原体,以防止新生细胞受到污染。
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9
 
Q: 所谓的黑胶虫污染?

A:培养细胞发现小黑点现象很严重,原来对“黑胶虫”一说嗤之以鼻,认为那不过是自欺欺人的借口,觉得怎么也不会发生在自己身上。但是真的就碰上了:细胞传代以后就出现细胞间黑点,细胞空泡化,很多类似凋亡、坏死的细胞,最终细胞漂浮,完全死亡。
上述现象很像所谓的“黑胶虫”。
我感觉实际是支原体感染以后细胞生长不好造成的碎片和感染原虫(现在看来是些胞外囊泡)的混合体。这种现象的直接原因是支原体等原虫感染,间接表象是小黑点,被以讹传讹成为了“黑胶虫”。
光镜下看不到支原体,但是可以看到支原体感染的终末现象——细胞凋亡坏死,释放出大量碎片,看起来就像小黑虫子。
查找类似的帖子——很多人是更换血清后出现这种问题;
说空气传播的可能是一个培养箱的人都用了同一种血清,而不是可以通过培养箱空气传播;感染最可能是牛源性的支原体,通过产道或血行感染。
所谓“细胞生长不受影响”,其实是污染的严重程度不高而已;
支原体污染严重就出现细胞大量空泡形成,细胞间空旷地带出现大量黑点,细胞最终凋亡、坏死,漂起来。有些国产血清写着建议灭活,其实是挂羊头卖狗肉,那个56度30分钟更多的是为了杀杀支原体的。实际上还有很多杀不死的。但可以降低产品支原体等微生物污染风险。用阿奇霉素杀支原体,小黑点可以得到抑制,不过我想根治就很难了,而且处理时间很长,至少一个星期。
以上是自己个人总结的一点看法。建议不要总拿子虚乌有的“黑胶虫”来说事。多考虑看不到的支原体,不要还停留在培根时代——只相信自己眼睛看见的。
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我记得是用新洁尔灭可以灭掉支原体
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