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标题:【讨论帖】用CCK-8测细胞增殖/毒性的疑难解答

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发表于 2016-3-12 15:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【讨论帖】用CCK-8测细胞增殖/毒性的疑难解答

各位好~
发现大家有很多关于CCK-8的问题，
这方面虽然算不上专家，
但还是有一定经验，
想着这边开一个整合的帖子，
如果大家有遇到相关实验上的问题，
都可以在帖子中回复我，
我会抽时间给大家简单简答，
交流的同时顺便学习，
希望能够帮到大家！
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发表于 2016-3-12 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
要不今天就先来一个预实验的操作方法吧，供各位借鉴：
在没有使用过CCK-8或者没有用CCK-8做过手头的细胞是，通常会建议做一个预实验摸条件，预实验的概念和标准曲线是相仿的，但不完全一样，这个我会在之后点出来，那么，怎么去做预实验？
我以Hela细胞举例子，
1.准备4块96孔板，每块板上都接种5个梯度的细胞数量，例如：5000、10000、15000、20000、25000，每个细胞数量做3个复孔
2.37°培养箱培育，一般贴壁细胞培养2-4小时，如果悬浮细胞的话可以省去孵育时间
3.每孔加入培养基1/10量的CCK-8，例如，培养基是100微升，那么CCK-8的量为10微升（如果是24孔板或其他规格的孔板，加入1/10培养基的量即可）
4.4块板同时放入孵育箱孵育，1小时后拿第一块板检测OD值，2小时后拿第二块板检测OD值...以此类推，最后我们可以得到4个不同时间段，细胞数量和OD值之间对应的曲线
5.把得到的4条曲线绘制在一个坐标轴上，一般情况下，我们寻找OD值为1时，所对应曲线的细胞孵育条件，例如：OD为1时，可以对应“孵育时间为2小时，接种细胞数为20000”，或者“孵育时间为1小时，接种细胞数为25000”，再或者“孵育时间为3小时，接种细胞数为15000”等，选择其中一种孵育条件，作为之后实验的一个参考标准

那么，这样的一个预实验算是完成了，我们选择的这条曲线，也称为标准曲线。

【有什么问题可以在下面留言，明天会更新实验中遇到关于OD值偏低或者过高的分析以及解决方法】
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发表于 2016-3-12 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
认识一个老师，整个团队在美国进行几个项目的研究，回国后在复旦上医有了自己的实验室，除了自己课题，也帮一些企业做药物前期筛选，告诉我在美国就会用刃天青（Alamar blue）和CCK-8同时检测细胞的活性，虽然我自己没有做过Alamar blue，不过我把自己知道的一些写一点下来：

首先是原理：CCK-8的原理我不在累赘重复介绍了，Alamar blue简单说一下，Alamar blue具有一定氧化性，与活细胞中的线粒体酶反应并被还原,还原后染料发生颜色和荧光改变,其深浅与活细胞数量成正比。通过与对照组的比较得到试验组的增殖率,从而测定受试样品的细胞毒性。
我们可以发现两种方法的共同点：被检测细胞都要求是活细胞，死细胞其体内脱氢酶和线粒体酶的活性均受影响甚至失活，无法用这两种方法检测（这边插一句，要检测死细胞数量，可以利用检测上清液中LDH含量，跟对照组对比获得死细胞的量），另外，肉眼观察反应过后都会有明显颜色的变化

不同的地方是：Alamar blue的结果会分别反映在OD值和荧光强度上，而CCK-8主要集中反应在OD值，也就是说Alamar blue同样适用于荧光显微镜，两种方法参与反应的酶不同，必要时需要取舍，例如做代谢，研究细胞内脱氢酶，这时候并不推荐使用CCK-8，会存在一个背景值吸收的问题，拿来发文章的话，编辑不一定认可这个结果，相反，Alamar blue也会存在这样的情况，总之，酌情选择

操作：细胞悬液的制备包括铺板等前期操作基本相同，在加样的时候溶液和培养基最适比例有略微差别，Alamar blue的working solution和培养基的比例推荐在1:5，CCK-8则推荐在1:10，孵育时间根据具体细胞而定，孵育完成之后，分别检测吸光度

性价比：2个方法都有适合的细胞，适合的体系，排除实验外的干扰因素，CCK-8灵敏度比Alamar blue略高，对于副孔重现的效果更好，相对的，CCK-8的价格较Alamar blue高出0.5-1倍（当然，这边是以同仁的CCK-8举例，如果是国产CCK-8，两者价格没有较大差距）

两种方法都有自己的优劣势，根据自己需要选择最合适的方法，检测增殖，不需要局限于比色法，Brdu 核侵入染色、H3同位素标记、ATP Light 荧光显色...都可以用来检测增殖，就像转染方法，电转、脂质体转、钙转、病毒侵蚀、逆转录侵蚀、腺病毒侵蚀等...扯远了，希望对你有帮助
有疑问的话，可以给我留言
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发表于 2016-3-12 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
今天更新一份资料，是常见细胞在使用CCK-8的推荐接种条件，大家可以参考一下：
        细胞种类        接种细胞数量         建议加入 CCK -8试剂 后培养时间
1        A549 (人肺癌)         8,000/孔        2-3 hr.
2        AGS         10,000/孔        2 hr.
3        ASTC-a-1        50,000/孔        3.5 hr.
4        B16 (黑色素瘤)         4,000/孔        3 hr.
5        Balb/c 3T3         10,000/孔        4 hr.
6        Bcap-37 (人乳腺癌)         5,000/孔        4 hr.
7        Bel-7402 (人肝癌)         5,000/孔        2 hr.
8        CTLL-2         16,000/孔        3 hr.
9        EaHY926         20,000/孔        2 hr.
10        ECV304 (人脐静脉血管内皮细胞)         20,000/孔        2 hr.
11        HaCaT         10,000/孔        4 hr.
12        HAEC         10,000/孔        4 hr.
13        HEK-293        5,000/孔        2 hr.
14        HepG2 (人肝细胞癌)        2,000/孔         2 hr.
15        Hela (人宫颈癌)         2,000-25,000/孔        2 hr.
16        Ho-8910 (人卵巢癌)        80,000/孔         3 hr.
17        HL60 (人原髓细胞白血病)         30,000-45,000/孔        3 hr.
18        HLF        10,000/孔        1 hr.
19        HS 766T (人胰腺癌细胞)         100,000/孔        2 hr.
20        Huh7         100,000/孔        2 hr.
21        HUVEC        5,000/孔        4 hr.
22        Hepatocytes (肝细胞)         30,000/孔        2-3 hr.
23        HSC         10,000/孔        3 hr.
24        K562        40,000/孔        6 hr.
25        L1210 (小鼠淋巴白血病)        200,000/孔        3 hr.
26        L929 (小鼠成纤维细胞株)         10,000/孔        4 hr.
27        MCF-7 (人乳腺腺癌)         10,000/孔        2-3 hr.
28        MN9D         5,000/孔        4 hr.
29        NIH3T3        10,000/孔        1-2 hr.
30        NRK (大鼠肾细胞)         5,000/孔        4 hr.
31        P815         10,000/孔        3 hr.
32        PC12        10,000/孔         3-4 hr.
33        (人胆管癌细胞系)QBC939         5,000/孔        4 hr.
34        Raji (人Burkitt's淋巴瘤)        100,000/孔        5 hr.
35        RAW264.7 (小鼠巨噬细胞)        20,000/孔         2 hr.
36        SD大鼠脾淋巴细胞         3×105-4×105/孔        4 hr.
37        SGC-996         150,000/孔        2 hr.
38        SH-SY5Y         12,000/孔        3 hr.
39        SK         80,000/孔        3 hr.
40        SMC         20,000/孔        4 hr.
41        SMMC-7721 (人肝癌)         1,000/孔        2 hr.
42        SPC-A1 (肺腺癌)         3,000/孔        3 hr.
43        SW480         1,000/孔        2 hr.
44        T-24 (人膀胱变移细胞癌)         80,000/孔        3 hr.
45        Tca8113        10,000,000/孔         4 hr.
46        T淋巴细胞         1×104-1×106/孔        2 hr.
47        U937         200,000/孔        3 hr.
48        Vero E6        30,000/孔        2 hr.
49        Wish细胞 (人羊膜细胞)         30,000/孔         2 hr.
50        7901        15,000-20,000/孔        4 hr.
51        成纤维细胞        1,500/孔        3 hr.
52        大鼠系膜细胞        10,000/孔        2 hr.
53        骨髓间充质干细胞        4,000/孔        3 hr.
54        结肠癌Caco-2细胞        10,000/孔        3 hr.
55        乳鼠心肌细胞        10,000/孔        0.5-3 hr.
56        人成骨细胞        5,000/孔        3 hr.
57        人外周血淋巴细胞        50,000/孔        4 hr.
58        人支气管上皮细胞        2,000/孔        4 hr.
59        神经母细胞瘤        10,000/孔        2 hr.
60        肾小球系膜细胞        1,000/孔        1 hr.
61        树突状细胞        1,000,000/孔        4.5 hr.
62        兔软骨细胞        1,000/孔        3-4 hr.
63        小鼠脾脏T淋巴细胞        2,000,000/孔        4 hr.
64        原代大鼠肝脏细胞        30,000/孔        3-4 hr.
65        原代胃癌细胞        10,000/孔         4 hr.

Bingo！字体间隙不太方便修改，就这样吧！
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发表于 2016-3-12 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常感谢；我是这样做的：CCK-8加入后孵育分别取0.5h，1h，2h，3h测同一板的OD值，之间间隔的时间是放回培养箱继续孵育的；出现我上述差异；不知我这种做饭有失妥当？还有疑问是：论坛里很多人说OD值要为1比较 ...

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【CCK-8加入后孵育分别取0.5h，1h，2h，3h测同一板的OD值，之间间隔的时间是放回培养箱继续孵育的；出现我上述差异；不知我这种做饭有失妥当？】
不建议用同一块板做，我简单说明一下，0.5h的时候去检测，结果能够代表孵育0.5h时，细胞生长的状态，但是，再放入培养箱，过0.5h再去检测，其结果并不代表“孵育1小时的细胞生长状态”，因为你忽略了检测的这段时间内CCK-8和细胞的反应，另外，在整个过程中，增加了实验数据稳定的风险，所以我一般会建议准备4块板，同时加CCK-8进行孵育，分别在4个时间段取其中一块板去检测，这样体现的数据更具有代表性，也是尽可能去避免了误差
【论坛里很多人说OD值要为1比较好？这个1是指对照组的OD值吗？】
我举个例子，比如我们做毒性实验，加入的药物对细胞有一个杀伤作用，那么理论上来说，只要加入药物，那么OD值就会比不加药组的OD值要低，所以我们推荐正常组细胞在加入CCK-8孵育过后能够达到OD值为1甚至1.5这样的数值，那么加药组在同等孵育情况下，OD在1或者1.5以下随着药物浓度的增加而逐渐变小，并带有明显趋势，如果正常组的细胞OD值比较小，比如0.5，那么加入药物之后，OD值要比0.5还要低，整体的趋势就拉不开了，这样说可以理解为什么要强调OD值为1的原因么？
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 小中大
"建议加CCK-8的时候，枪头45°贴孔的侧壁，尽量加在底部，",加CCK-8的时候是用排枪吗？10uL的量感觉总是加不准。若枪头触及底部，那就应该每加一次cck就换一次枪头了？
楼主讲的很详细，赞！经验谈，继续 ...

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【加CCK-8的时候是用排枪吗？】
一般建议用排枪，缩短加样以及CCK-8的时间，保证孵育之前，每个孔的状态一致，如果实验室只有普通的移液枪，也可以，不过尽量保证在短时间内加完。

【10uL的量感觉总是加不准】
无论是排枪还是移液枪，都可以设置加样的量，量程足够的话，设置在10ul就可以了，枪有两档，一般推荐加到第一档就可以了，虽然那样可能整体的量不到10ul，但只要保证整体的状态一致就行，如果加到第二档，很有可能出现气泡或者带走培养液。

【若枪头触及底部，那就应该每加一次cck就换一次枪头了？】
对的，每次加完枪头都会不可避免沾有培养基或细胞或CCK-8，所以建议每加一次就换一次枪头，可以事先准备96孔板固定板，把枪头都摆好，加样的时候就可以快速高效了~
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 小中大
做药物实验，用CCK8测细胞毒性的对照组需要加入药物溶剂吗？我用DMSO溶的药物，各组成分分别是：
对照组：细胞+培养基
实验组：细胞+药物+DMSO+培养基
空白对照组：DMSO+培养基
我的药物用HPLC走过，吸收峰是在 ...

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需要加入DMSO溶解的情况我之前遇到过，实验先设计了一个预实验：
对照组：细胞+培养基
实验组：细胞+培养基+药物+DMSO+CCK-8
Blank1：培养基+药物+DMSO+CCK-8
Blank2：培养基
由于是预实验，这边多设了一个Blank，每个组设了5个副孔，
Blank1主要是观察药物和CCK-8是否有反应，如果OD值偏高的话，
说明药物有一定的还原性，需要在加入CCK-8之前进行清洗并更换培养基的操作。
另外，通过实验组和Blank1的对比，判断在加入DMSO的环境下，
CCK-8是否能够跟药染的细胞反应，如果OD值没有明显差异，
在确保药物已经达到对细胞杀伤的浓度下，可以判断DMSO是否会对反应有影响。
补充的一点是：DMSO溶解药物后，会让药物具有一定的粘附性，预实验是做下来只是让自己心里明白，之后的实验我还是每次都会清洗换液。
希望能够帮到你！
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 小中大
楼主是个很NICE的人，感谢。。我现在做悬浮细胞的CCK8，发现比复孔之间OD值相差比贴壁细胞要大很多，甚至>0.5，这个靠增加复孔数或是去除两个最值能解决吗？我尝试了几个细胞数梯度，发现都存在这样的现象。puz ...

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【我现在做悬浮细胞的CCK8，发现比复孔之间OD值相差比贴壁细胞要大很多，甚至>0.5，这个靠增加复孔数或是去除两个最值能解决吗？】
悬浮细胞副孔间差异大的情况，很有可能是2种原因造成的：
1.团聚，某些悬浮细胞在生长时会出现细胞团聚的现象，导致每孔间细胞和CCK-8之间的反应不充分，也就容易使副孔间的OD值拉开差距
2.没有用平板离心机离心，悬浮细胞在加CCK-8孵育之后，建议用平板离心机离心，每孔吸取一定量的上清液至新的96孔板，然后再用酶标仪检测，原因是基于酶标仪的检测原理，通俗一点来讲，酶标仪在每孔底部射出一定波长的检测光，通过光在液体中的折射来读取最后的吸光度，悬浮细胞如果没有经过离心处理，细胞半悬于体系中，容易对光的折射产生较大影响，由于大多是酶标仪在检测吸光度时使用单光源检测，所以为了避免不必要的误差，会使用平板离心机先离心，再移液，达到最后检测的标准
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楼主，你好！我现在做的是HUVEC细胞，我之前是加的5000个细胞/孔，贴壁24小时后，加药处理24小时，然后再加CCK8孵育4小时，发现OD值3点多，需要怎么调整呢？减少细胞数量还是减少孵育时间呢？如果加药处理48小时的话 ...

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减少细胞数量或者减少孵育时间，都可以操作。
这两个方法都可以控制OD值，OD值如果达到3.0，参考价值会减弱，不知道你的药物是粗增至还是抑制，前者，正常组OD值控制在0.5左右，后者，正常组OD值控制在1.0-1.5就可以了。
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 小中大
买了500孔的，连个说明书都不带
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