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标题:【求助】亚细胞定位前后不一致，请帮忙分析原因

嗅嗅[使用道具]
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发表于 2016-3-12 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】亚细胞定位前后不一致，请帮忙分析原因

半年前构建了目的蛋白-GFP的融合蛋白（GFP在C端，做亚细胞定位，我是做植物的，用的是烟草瞬时表达，一直做的结果是线粒体定位，已经下了结论认为是线粒体定位，最近又顺带看了一下，结果麻烦大了，显示的是膜定位，做了好几次都这样，重新提质粒重新转农杆菌烟草表达还是膜定位，又把GFP连到我的蛋白的N端，也是这样，怎么办啊？感觉要疯了，请各位多多提出自己的看法，非常感谢！
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079777chao[使用道具]
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发表于 2016-3-12 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你最新几次做，线粒体中有信号吗？
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发表于 2016-3-12 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 079777chao 于 2016-3-12 17:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你最新几次做，线粒体中有信号吗？

没有了，所以问题很严重，有点不知所措，请问有什么建议吗？
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ROSE李[使用道具]
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发表于 2016-3-13 18:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先，检查你用的农杆菌，看看有没可能被污染了。其次，膜信号很可能是自发荧光，现在你的融合蛋白很可能没有很好地表达，有条件最好做WB验证一下表达，另外也可能需要考虑重新准备一批农杆菌。再次，你做定位有没用合适的marker，最好把marker共转进去作对照。
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发表于 2016-3-13 18:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
二者的阴性对照结果如何？
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发表于 2016-3-13 18:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 ROSE李 于 2016-3-13 18:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
首先，检查你用的农杆菌，看看有没可能被污染了。其次，膜信号很可能是自发荧光，现在你的融合蛋白很可能没有很好地表达，有条件最好做WB验证一下表达，另外也可能需要考虑重新准备一批农杆菌。再次，你做定位有没用合适的marker，最 ...

我提了农杆菌的质粒测序，没有问题，做的就是共定位，用的是线粒体定位的蛋白作为阳性对照；要说我的融合蛋白没有很好地表达，我做了好几次了，这个可能性是有，但是挺低的；我烟草表达蛋白，提取了线粒体，做了western blot，能够抗出来，但是亚细胞定位突然出现这个情况，让我不知该怎么面对这个个问题，没法忽视这个问题啊？
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发表于 2016-3-13 18:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 二丫头466 于 2016-3-13 18:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
二者的阴性对照结果如何？

我做的是共定位，相同的菌在烟草表达，出现了前后不一致的结果，共定位的阳性对照没有问题，阴性对照的话，就是空载，也没问题
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ROSE李[使用道具]
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发表于 2016-3-13 18:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 嗅嗅 于 2016-3-13 18:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我提了农杆菌的质粒测序，没有问题，做的就是共定位，用的是线粒体定位的蛋白作为阳性对照；要说我的融合蛋白没有很好地表达，我做了好几次了，这个可能性是有，但是挺低的；我烟草表达蛋白，提取了线粒体，做了western blot，能够抗出来， ...

先别急，我倾向于认为是自发荧光太强，你的蛋白表达偏弱，WB有时候过于灵敏。如果之前能确定线粒体定位，那这个新结果说不通。最好从农杆菌开始做个重复。
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ROSE李[使用道具]
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发表于 2016-3-13 18:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
另外，线粒体蛋白也存在可能表达在细胞质内。我对这块不熟悉，但感觉可能有这几个方面可以考虑，第一，你做的蛋白是否为细胞质合成再转入线粒体，那就可以解释为什么细胞质中可以看到，对于这个情况，我感觉是否改变农杆菌侵染后观察时间，给蛋白足够时间运到线粒体内。其次，有些线粒体膜蛋白好像有转运识别肽段，可以让这些蛋白进出线粒体，不知道有没有做相关分析的网站，你可以查查看。再次，线粒体基质蛋白不一定只在线粒体基质中表达，它们也可以在线粒体外表达，可能有什么机制影响这个。

另外做个广告，有兴趣欢迎加入我办的植物生理群
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嗅嗅[使用道具]
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发表于 2016-3-13 18:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常感谢楼上的建议，编码我的蛋白的基因不属于线粒体基因组，应该不是在线粒体合成的蛋白；我做过一些生物信息学分析，好几个网站分析的结果不一致，后来就没管这些结果；前后操作，表达时间基本一致，所以侵染后观察时间是否有影响不好说。总之，非常感谢您的建议！
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