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标题:[求助]转化什么都没有长！？怎么回事啊？

章鱼小丸子[使用道具]
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发表于 2011-10-21 12:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]转化什么都没有长！？怎么回事啊？

[求助]转化什么都没有长！？怎么回事啊？


这次转化，包括阳性都没有长斑！质粒师兄说以前用过转化还挺好的。空白也没有长，是感受态有问题还是转化过程出了问题？各位高手帮帮忙吧，两个突变体做了将近一个月了都没有出来！！！
感受态制备：
1 3mL LB加3微升Cam和10微升的BL21（DE3）plyS甘油菌，37度250转摇过夜
2 50ml LB + 50微升Cam+500微升过夜菌，37度250转，摇到OD600约为0.35
3 3000转4度 离心10分钟，弃上清液
4 细菌沉淀用10毫升冰浴预冷的100mmol的CaCl2悬浮半个小时以上，我大概是有四十分钟，这个好像没有什么影响的
5 2500转4度离心10分钟，弃上清液
6 用2ml预冷100mmolCaCl2悬浮白色细菌沉淀，——以前都是用1ml，第二步的
OD600是摇到大概0.2，这次因为师兄要用，看细菌沉淀也比较多，就多加了点 这个应该是没有什么影响的啊

感受态是4度冰箱放了八个小时后使用的

转化中也是先冰浴半小时，再42度120s温浴，冰浴五分钟以上，涂板
这次最后一步冰浴时间不是很确定，中间老板有事，所以可能时间不是很准但是师兄说这个关系不大的

大家帮我看看啊，我想不出来什么地方有问题啊。

[ 本帖最后由 章鱼小丸子 于 2011-10-21 12:51 编辑 ]
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##蒙奇奇[使用道具]
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发表于 2011-10-21 12:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
转化最后冰浴5分钟后一定得加LB摇45分钟至1小时，以便外源质粒基因表达
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smile_smile[使用道具]
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发表于 2011-10-21 12:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
阳性是空质粒么？如果空载体都没有长，那可能就是感受态的问题了
还有我们４２度水浴一分半，不过这个不成什么问题
还有一些小问题，你再看看，比如说涂错板拉，刮刀太烫啦，没长够时间了等等，（这些错误我都犯过：P）
楼上说的加LB摇，连接产物转化是必须的

建议你再作作吧，一次出不来说明不了什么问题的  
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IAM007[使用道具]
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发表于 2011-10-21 12:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
酶切位点BamH I和NdeI 用BamH I的buffer酶切时间是37度3h，后来一次是切了八个小时，效果也不好！
质粒不是直接拿pET－11c，是重新抽的，这个质粒上面的BamH I和NdeI这一段是师兄连接的突变体小片段。
我切的效果一直不好，连接转化后阴性总是长斑，而且很多，和质粒阳性对照差不了多少！
我的质粒是转到BL21（DE3）plyS的，有人说这个菌里面抽出来的质粒酶切效果都不好，容易切散。还有什么其它的建议啊？
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IAM007[使用道具]
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发表于 2011-10-21 12:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
酶切位点BamH I和NdeI 用BamH I的buffer酶切时间是37度3h，后来一次是切了八个小时，效果也不好！
质粒不是直接拿pET－11c，是重新抽的，这个质粒上面的BamH I和NdeI这一段是师兄连接的突变体小片段。
我切的效果一直不好，连接转化后阴性总是长斑，而且很多，和质粒阳性对照差不了多少！
我的质粒是转到BL21（DE3）plyS的，有人说这个菌里面抽出来的质粒酶切效果都不好，容易切散。还有什么其它的建议啊？
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章鱼小丸子[使用道具]
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发表于 2011-10-21 12:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不明白，最后加LB要45分钟到一个小时？
加多少？
不是直接涂板37度（LB板）左右放置过夜么？
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发表于 2011-10-21 12:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
热激2分钟后立即冰欲,然后加LB液体培养基摇床45-60分钟,然后涂板才可以转化成功,注意同时要做阴性和阳性对照结果才更有说服力.
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-10-21 12:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我曾做过两周的转化，做不出来问题很多。比如说1，氯化钙的浓度是否对，一定要冰浴过才行；
2，杂菌是不是比较多；
3，做感受态细菌不要转接很多次否则效率会很差；
4，感受态在24小时内效率会越来越高，超过了就会降低；
5，热休克一定要42度90--120秒，我一般用100秒；
6，做转化是千万不要移动，否则转进去的质粒会跑出来影响转化；
我的一个师兄曾犯过把固体培养基的配方搞错了，而做不出来，有时一些小问题会被忽视掉。总之，不要气馁，多想一想。
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-10-21 12:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的建议：
1.你的菌种是保存在超低温冰箱里的？最好是先用还未解冻的菌种划板，过夜生长后，挑取单菌落再用3-5毫升的LB摇过夜。

2.做感受态用到的试剂最好是用新鲜的，刚灭过菌的，要保证试剂的质量。并且在做的时候一定要把所有东西都放在冰上预冷。

3.OD值到0.2还是稍微低了点，尽量能达到0.35左右。

4.在悬浮菌液的时候注意吹打的力度并且要保持冷的状态。

5.感受态细胞在最后用氯化钙悬浮以后，可以置于制冰机内约12-24小时，这样它的转化效率会提高很多。

6.转化的过程中，热击后加200微升左右的LB，并置于摇床摇45分钟左右，最后再涂板。

7.注意此过程中的细节问题，应该可以达到你要的理想结果的。祝你好运！！  
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章鱼小丸子[使用道具]
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 小中大
十分感谢大家如此详细的回答！太感谢了！
ps ，
最后加200毫升LB！？ 还是笔误，200微升？？：）
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