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标题:[求助]PCR污染，原因不知道，请各位高手帮忙分析，谢谢

ha111[使用道具]
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发表于 2011-10-21 12:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]PCR污染，原因不知道，请各位高手帮忙分析，谢谢

[求助]PCR污染，原因不知道，请各位高手帮忙分析，谢谢


设计了一对引物，扩增基因组，片段长度大小约300bp，结果，很漂亮，但是阴性对照也一样很“漂亮”，简直分不出来，最后三个孔都是阴性对照，没加模板。


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发表于 2011-10-21 12:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
然后又做了两次，都是这样，于是怀疑操作过程某一步骤受污染，于是换了一个人做，一样的反应条件，一样的模板和引物，但是酶和buffer，dNTP，水都用另外一套，枪也用另外一套，结果电泳结果：还是一样，最后3个孔是阴性对照（由于这次用的普通TAQ酶，所以有非特异性条带）


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发表于 2011-10-21 12:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
？ ？


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 小中大
怀疑医引物污染了，于是重新融解两只引物，用另外一套枪，另外的水，新到的HS taq酶及buffer，dntp，结果还是这样：最后2个孔是阴性对照


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发表于 2011-10-21 12:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Hi,DEAR 师傅，

NICE TO MEET YOU .

我是新手，多多包涵与关照,please。

目前我在新加坡国立大学已经做了10次REAL TIME PCR 技术, 但是在阴性对照组(没有模板DNA，仅有DEPC，QUIAGEN公司的PCR反应液与b ACTIN 的引物PRIMER FORWARD /REVERSE)中总出现不应该出现的峰值(PEAK CURVE，本应该出现一条水平线)，已经快一个月了，还未有结果，真是苦恼之至！。

我想请教关于REAL TIME PCR 的问题：

1.？

2.如何在阴性对照组中避免DNA污染的问题？

SORRY ,PLEASE EMAIL :cgca2002@163.com

URGENTLY，MANY THANKS 。

BEST REGARDS，

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ha111[使用道具]
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发表于 2011-10-21 13:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
于是又新溶解两只引物，用新的水，新的酶，新的枪
电泳：第二个孔是阴性对照
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发表于 2011-10-21 13:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你换一下pcr管换个地方再作,可能是空气中存在蒸汽污染
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发表于 2011-10-21 13:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我在做PCR时，扩增短片断，也有很多时候阴性对照出现条带
实验室也有人碰到过，不知道是怎么回事？

难道没有其他人碰到这种问题么？  
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发表于 2011-10-21 13:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我在遇到这种情况时

就换另一套引物，长一点的，用来筛选
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 小中大
你的阴性对照是什么？

可以不加模板，也不用补加水。

实在不行，就只带上你的引物，其余都不带，到别人的PCR实验室做一下看看。如果没问题再回头一个一个的找原因。

如果还是解决不了，就换条引物吧。可能你的引物的特异性不好。

另外请考虑你溶解引物的水是否也已受到污染。
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