[求助]有谁知道AS-PCR吗？

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标题:[求助]有谁知道AS-PCR吗？

我佛慈悲[使用道具]
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发表于 2011-10-21 13:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

[求助]有谁知道AS-PCR吗？

我查到一些资料，其中国外的使用AS-PCR后都用DNA测序，我还没有这个条件，如果不进行测序行吗？

我佛慈悲[使用道具]
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发表于 2011-10-21 13:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

AS-PCR就是等位基因特异PCR,用来检测SNPs.

冰儿0109[使用道具]
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发表于 2011-10-21 13:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你只要将几个样品送到别处测序，以证明扩增产物就行了，我有一个师兄做过。

+田田+[使用道具]
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发表于 2011-10-21 13:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

森林木[使用道具]
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发表于 2011-10-21 13:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

AS-PCR 的关键是引物的特异性！

同时为了确保扩增的特异性，即实验的可信度（排除假阴性和假阳性），必须要有标准品。

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我查到一些资料，其中国外的使用AS-PCR后都用DNA测序，我还没有这个条件，如果不进行测序行吗？
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我想老外也不是每个标本都拿去测序，如果是那样的话，直接测序不就得了，还要费两回事干啥？我想正如楼上一位战友讲的那样，随机挑选几个（也可以多些）送去测序，确定好阴性对照和阳性对照，就可以放手做了！

PS:我也正在做这方面的实验，有问题大家共同交流！

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3. 仅仅靠引物最后一个碱基的不同来判断扩增结果，如何区别假阴性与假阳性？换句话说，这样的把握有多大？
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这个问题还是别沉下去！

我设计的引物也是只有最后一个碱基不同，而且文献上的引物序列有很多也是这样的，3‘末端只错配一个碱基能屏蔽掉非特异扩增？

希望群中有关高手讲讲引物设计的另类技巧（PS:不要总是讲大家都知道的原则性问题噢，比如：引物一般有.......等等。）

蝴蝶结子[使用道具]
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发表于 2011-10-21 13:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

正好借东风问两个问题：
1. 内引物一般有2条，可以2条都是正向的，仅有最后一个碱基不同；也可以一条正向，一条反向的。你们觉得哪种比较好？
2. 内引物的参数多半由源序列决定，请问您如何处理好TM值，GC含量等问题；和外引物的TM值，GC含量有什么关系要注意吗？
3. 仅仅靠引物最后一个碱基的不同来判断扩增结果，如何区别假阴性与假阳性？换句话说，这样的把握有多大？

3.以我看到过的文献和我作过的实验,认为,仅仅靠引物最后一个碱基的不同来判断扩增结果并不很准确,可以通过将倒数第二个碱基故意设置成错配来增加最后一个碱基的识别准确度.
此外,我的另一点感受是内对照引物的Tm值与特异引物的Tm值比高一点为好,这样在编制PCR程序时就可以分阶段扩增,而特异引物的Tm值则越接近越好.

店小二[使用道具]
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发表于 2011-10-21 13:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位高手：用那么复杂的设计引物吗？实质上我觉得AS-PCR既然利用其等位特性，用来检测异质性更好一些，而且也可以对其中一种变异体进行相对定量。当然也可以用来检测SNP，但是用于此我个人认为只是在该位点缺少相应的内切酶时才凸现出并利用AS-PCR的方法来检测，当然也可以检测各种其他变异，包括突变。
请问我说的对吗？请指正！

我佛慈悲[使用道具]
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发表于 2011-10-21 13:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回答得好，DXY关于AS-PCR的帖子好像不多，不如就让这个帖子成为集中讨论的AS-PCR专贴。供大家交流心得如何？

阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-10-21 13:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1. 内引物一般有2条，可以2条都是正向的，仅有最后一个碱基不同；也可以一条正向，一条反向的。你们觉得哪种比较好？
2. 内引物的参数多半由源序列决定，请问您如何处理好TM值，GC含量等问题；和外引物的TM值，GC含量有什么关系要注意吗？
3. 仅仅靠引物最后一个碱基的不同来判断扩增结果，如何区别假阴性与假阳性？换句话说，这样的把握有多大？

ASPCR的理论基础应是:引物3'末端的末位碱基在很大程度上影响着TaqDNA聚合酶的延伸效率。国外资料表明，引物3'末端碱基在错误配对时不同碱基的引发效率存在很大差异。当末位碱基为A时，即使在错配的情况下，也能引发链的合成，而末位碱基为T时，错配时引发效率大大降低，G、C居于中间。
因此内引物的正反向主要由3'末端的末位碱基决定。
由于内引物的位置由源序列决定，其TM值和GC含量只能通过引物长度的变化来调节，在考虑正反向时也可将TM值和GC含量考虑进去。外引物的TM值和GC含量应尽可能与内引物一致。
外引物可作内对照来区别假阴性。

阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-10-21 13:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很高兴有站友讨论这个问题，我以前在版面里提到过，但没有详细讲，我在这里给大家介绍一下基本概念。欢迎大家一起讨论。

Allele-specifice PCR一般用3’mismatch PCR，需要设计两个Allele-specific primer和一个common primer。我不知道上面站友指的内引物是不是指Allele-specific primer。一般AS-PCR需要在real-time PCR 仪器上做。以下是一个简单的示意图，两个Allele-specific primer的序列基本上是一样，只有3’不同，各自和SNP中的一个Allele一样。一般这两个Allele-specific primer的Tm设计成一样，所以有时其中一个primer会比另一个多一两个碱基，如果3’一个是A/T对G/C SNP，A/T的primer就可能要在5’多加一个碱基。Common primer的Tm一般设计稍微高一点。

2 allele-specific primers
5'
————————A
————————B
————————A———————————————
————————B———————————————

............................................. ——————— one common primer 3'

用3’mismatch PCR，一个样品分别做两个反应
反应 1： A primer+common primer
反应 2：B primer+common primer ，

AS-PCR可以用普通的SYBR green I 来检测产物，在任何real-time PCR仪器上都可以做，对于每个样品，如果是AA homozygous，就只有反应1有扩增曲线。如果是BB homozygous，就只有反应2有扩增曲线，如果是AB heterozygous，反应1，2都应该有扩增曲线。

AS-PCR对于Polymerase的要求比较高，一般的Taq是不行的，最好用Taq Gold （hot start enzyme)，当然还有其他更特异的酶。

测序只是为了检测所设计的引物和反应是否准确和特异，不需要对所有样品都做。做几个就行了。

因为一个样品要两个反应，所以有可能遇到假阴性，特别是杂合子，如果一个反应中漏加了样品，杂合子的结果就和纯合子一样了。这个比较难控制，需要很仔细的操作或者用robot做。

有时AS-PCR会遇到引物二聚体造成假阳性，这个可以用空白对照来检测。

AS-PCR是很好而且比较便宜的方法来做SNP genotyping。方法已经很成熟。

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