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标题:【求助】蛋白表达分子量偏大

huali[使用道具]
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发表于 2016-3-21 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白表达分子量偏大

最近在做重组蛋白表达，表达之后也有目的条带，但是就是分子量比理论值要偏大。我的质粒是经过测序的，没有碱基的缺失和突变。另外，我做的是SDS-PAGE.偏大5-50都不等，各位大师帮帮忙，解决下...  着急啊！！！
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发表于 2016-3-21 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

SDS-PAGE确定的分子量不是很准确的，有些蛋白的疏水性强，等电点高，在胶上跑得慢也不足为奇。只要确定表达的蛋白正确就可以了。
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wawa11[使用道具]
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发表于 2016-3-21 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

有些偏大很常见的，可以通过表达测试时设置阴性对照来初步确认。
进一步确认可以通过活性检测。
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mimima[使用道具]
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发表于 2016-3-21 11:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

对照是有的 就是表达的目的蛋白偏大
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wwwh[使用道具]
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发表于 2016-3-21 11:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

楼主你倒是说说目标蛋白的大小啊。 目标蛋白5KD偏大5KD ，跟目标蛋白50KD偏大5KD，那不是一个概念啊。
SDS-PAGE是不太准确，不过50KD的话，就太夸张了吧- -
而且SDS-PAGE根据的就是蛋白分子量大小，蛋白被负电荷包裹主要受电场力作用迁移，跟等电点疏水什么的关系不大啊。
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发表于 2016-3-21 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

SDS-PAGE虽然把变性变性并且由于蛋白表面结合了SDS而带负电荷，但是实际上疏水性强的蛋白变性不完全，所以不会是标准的球形。等电点高的蛋白即使结合了SDS，所带的电性也比较少，所以它们在胶上移动比较慢。
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发表于 2016-3-21 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

为什么你们表达蛋白都不用MS确认一下精确的分子量呢？
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发表于 2016-3-21 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

是这样的，我的理论值是70KD,但是在脚上的为止已经有120KD了，还有一个样品的理论值是37KD，胶上就是四十多了，还有请教一下蛋白序列的亲疏水性怎么判别呢
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发表于 2016-3-21 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

请问下你这两个蛋白是分别跑的胶么？
如果跑分子量大的蛋白，可以用浓度低点的胶， 这样会比较准确。不然来不及扩展开就电泳停了。
蛋白中氨基酸，非极性多的表现为疏水，极性多的表现为亲水。
一般蛋白内部以非极性氨基酸为主，外部会多点极性的。
如果要准确预测，有软件可以算序列的物理特性的。详细你可以上ExPASy 看看
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发表于 2016-3-21 11:14 资料  个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

MS是质谱的简称 mass spectrum
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