[求助]如何在阴性对照组中避免DNA污染的问题？

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标题:[求助]如何在阴性对照组中避免DNA污染的问题？

8princess8[使用道具]
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发表于 2011-10-21 15:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

[求助]如何在阴性对照组中避免DNA污染的问题？

我是新手，多多包涵与关照,please。

目前我在新加坡国立大学已经做了10次REAL TIME PCR 技术, 但是在阴性对照组(没有模板DNA，仅有DEPC，QUIAGEN公司的PCR反应液与b ACTIN 的引物PRIMER FORWARD /REVERSE)中总出现不应该出现的峰值(PEAK CURVE，本应该出现一条水平线)，已经快一个月了，还未有结果，真是苦恼之至！。

我想请教关于REAL TIME PCR 的问题：

1.？

2.如何在阴性对照组中避免DNA污染的问题？

mimili_901[使用道具]
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发表于 2011-10-21 15:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

加DNase处理一下，可看该帖
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=1206309&sty=3')

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发表于 2011-10-21 15:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

加DNase处理一下，可看该帖
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8princess8[使用道具]
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发表于 2011-10-21 15:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

10ul 总体积的反应液应该加多少ul 的DNAase？THANKS AGAIN.

JK.jon[使用道具]
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发表于 2011-10-21 15:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不知道你所说的阴性有曲线是怎么样
如果仅仅是有点飘起
那么就不是有DNA污染
如果可以看到是明显的扩增曲线
那么就是有污染存在
应该换个场所
如果是前者
而可能是你的酶不好或太多
或者是你镁离子浓度太高了

JK.jon[使用道具]
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发表于 2011-10-21 15:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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发表于 2011-10-21 15:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

HI,MASTER,it is so kind of yoy;阴性有曲线:是渐进性上升的锯齿线;maybe 酶不好或太多or 镁离子浓度高

many thanks .

I will try to do it again and again, today I add 0.5ul DNAase into the negative control
reaction grooup of 9.5 ul volume.

best regards,

good lucky to you all

CGC NEARTU

冰岛老叟[使用道具]
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发表于 2011-10-21 15:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

加DNAase消化是不大科学的做法
是一种自欺欺人的做法
那还不如加EDTA更便宜，
它只要将镁离子螯合了
taq酶就没有活性了
根本就谈不上扩增曲线

8princess8[使用道具]
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发表于 2011-10-21 15:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

说的很对，加DNAase没有必要，不然的话，实验就没有意义了。

不过今天上午做了1个CAPILLARY TUBE，检测了2次，第一次检测没有峰值
曲线(完全水平线)，但是第二次检测就有峰值曲线了。同样一根管子检测有
不同的结果，似乎显得很奇怪(也许是REAL TIME PCR机器荧光敏感的问题)，唉，REAL TIME 也太实时了。

另外，我用REAL TIME PCR 机器检测10ul DEPC水3次，3次都为一条漂亮的水平线，REAL TIME还是实事求是的。

我该怎么办？

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发表于 2011-10-21 15:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

既然这样，
你就应该好好清洗仪器
或者
你应该注意在操作时，
不应该用裸露的手
直接接触CAPILLARY TUBE
另外手套也用无荧光粉的那种

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