生物质谱

我最近在做AMPK的蛋白纯化，用的是原核表达，诱导表达的大部分目的蛋白都是包涵体，小部分是可溶的。我就利用这小部分的可溶蛋白过了两次His亲和层析柱，纯化出来的纯度大概在85%以上，可惜在浓缩的时候出现大量沉淀（用超滤管浓缩），剩余的可溶性蛋白只有0.2-0.3mg/ml，我看文献中说AMPK蛋白在大于1mg/ml时容易出现聚集，但是我的蛋白浓度总是停留在0.2-0.3mg/ml的浓度，不知道怎么回事。另外跑电泳发现沉淀基本上都是我的目的蛋白，杂蛋白其实都还在溶液中。大家帮忙分析下原因，有什么好办法。谢谢啦。
另外也做AMPK蛋白方面实验的战友可以联系我哦。相互交流经验嘛。

你做的AMPK是人源的还是什么？我记得07年的时候酵母AMPK的结构已经解析了。放慢一点浓缩的离心力，离几分钟停下来将吸附在膜上的吹打下来，避免局部浓度过高造成的沉淀。

大鼠源的，参照文献Dietbert Neumann etc. Mammalian AMP-activated protein kinase: functional,heterotrimeric complexes by co-expression of subunits in Escherichia coli.Protein Expression and Purification 30 (2003) 230–237.的确，酵母的、人源的AMPK结构都已经解析出来了。我们目前发现一个小分子激动剂，想做蛋白与化合物结合的结构分析，当然这个是后话，现在先是想表达出一个有活性的蛋白而已。
可能按你说的结果能好些，不过我觉得很奇怪，我的可溶性蛋白浓度总是在0.2-0.3mg/ml，再怎么说浓缩了之后蛋白浓度应该升高了才对啊。我的buffer是：50mM Tris-HCl PH7.5, 1mM beta-巯基乙醇，1mM EDTA

我的buffer是：50mM Tris-HCl PH7.5, 1mM beta-巯基乙醇，1mM EDTA
我不太清楚你这个蛋白有什么特殊之处，对盐离子很敏感么？为何buffer的离子强度这么低？试过加100-300mM的NaCl没？

LS说的有道理~~离子强度太低的确可能会导致蛋白质容易聚沉~
另外你可以看一下人源的那个文献的method部分，看看人家是使用了什么样的条件~

恩，我试过加500mM NaCl，效果能好些，但是我还想打质谱鉴定下我的蛋白分子量，高盐会有影响的。

我看那篇文章引用次数还挺高的，你可以查查引用它的文章中有无详述。

甘油，或者少量triton助溶效果很明显。

恩，甘油我试过，会助溶，可是有一个问题，会严重影响蛋白定量，我们采用BCA试剂盒进行蛋白定量，用其它方法怕蛋白定量不准。

好的，谢谢。我在一篇文献中看到最后溶解的缓冲液是50mM Tris-HCl，300mM NaCl，1mMTECP，我试过，蛋白浓度也没达到1mg/ml。重新再做一遍看看吧。