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标题:[求助]再次求教:保存在-20℃的全血可以提取DNA吗?

gmjghh[使用道具]
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[求助]再次求教:保存在-20℃的全血可以提取DNA吗?

[求助]再次求教:保存在-20℃的全血可以提取DNA吗?


求教:我先把血放在4℃冰箱中1-数天,然后转移保存在-20℃冰箱内,现在差不多2个月了,可以从这些全血中提取DNA,做PCR吗?
谢谢!
急!
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BOSS2011[使用道具]
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有问题,可以的。我们从病人那里来的血不都是一次性取血后,因为工作量太大来不及做,就扔到冰箱里,什么时候有时间再拿出来分次抽提DNA进行PCR,并不影响结果,放心做吧。  
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gmjghh[使用道具]
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谢谢!请问你是用什么方法提取呢?我用的是碘化钠法,现在还没提出来
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韩梅梅[使用道具]
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Promega公司试剂盒从全血中抽提DNA:
1.  取EP管作标记后加入0.9ml 细胞裂解液(cell lysis solution),并颠倒数次使solution挂壁。
2.  取充分融化的全血0.2ml 轻轻混匀后,室温放置25min,其间颠倒2-3次。
3.  离心,13000rpm, 3min。
4.  弃上清, Vortex, 充分振荡20s,使沉淀物与余下液体能混合。
5.  加入0.3ml核裂解液,反复吹打至固体沉淀完全悬浮,液体混浊。之后 37℃ 放置30min。
6.  加入0.1ml蛋白沉淀,充分混合,使蛋白完全沉淀。
7.  离心,13000rpm, 3min.
8.  转移上清于另一干净EP管中,加入0.3ml异丙醇,充分混合。
9.  离心,13000rpm, 3min.
10.  弃上清,70%乙醇洗两次。
11.  弃上清后,室温下干燥15-20min.
12.  待完全干燥后,加入DNA 溶解液0.1ml,65℃水浴中溶1.5-2h.
13.  电泳确定后,测OD 260 OD 280 值判断含量和浓度。
14.  4ºC保存,备用。

读研时,也自己配过细胞裂解液,现在配方忘了,我查了以后再告诉你。
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韩梅梅[使用道具]
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裂解液:10mmol/l Tris-Cl (PH 8.0)
0.1mol/l EDTA (PH 8.0)
0.5 %(m/v)SDS
20ug/mg 无DNase的胰RNase (现用时加200ul配好的20ug/mg Rnase)
(后来发现不加无DNase的胰RNase 也没有太大影响)
血完全融化后加等V 的PBS稀释后回收沉淀,加入裂解液(用时现加proteinase K终浓度为100ug/ml)37度过夜,有时也65度半个小时,不过后者好象结果不太好,余下的步骤就是酚,仿抽提了,祝好运吧!
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zhezhe[使用道具]
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我也是将全血保持再-70c冰箱中,我听说这样保存1-2年都没问题,当然这样容易导致溶血而影响dna提取,但应该没有太大影响的,  
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韩梅梅[使用道具]
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-70? 太夸张了吧,不用那么低的温度吧? 我们一般都放在-20就好了。没放过那么低。
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04906[使用道具]
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应该没问题的,我试过。不过存放时间越长,提取效果越差,我以前保存的血样放在-80℃大约一年半后提取效果就明显比刚采的效果差了。  
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韩梅梅[使用道具]
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-80℃存放应该比-20℃好的多,我提取的血液全放在-80℃,半年了,没有多少问题!  
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BOSS2011[使用道具]
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有问题,可以的。我们从病人那里来的血不都是一次性取血后,因为工作量太大来不及做,就扔到冰箱里,什么时候有时间再拿出来分次抽提DNA进行PCR,并不影响结果,放心做吧。  
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