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标题:[求助]脂肪组织提RNA

lgm[使用道具]
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发表于 2011-10-22 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]脂肪组织提RNA

[求助]脂肪组织提RNA


各位高手:
你们好!我无法从脂肪组织中提取总RNA(用Trizol法),不知能否介绍些宝贵经验,在下万分感激!
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蝴蝶结子[使用道具]
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发表于 2011-10-22 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
分子克隆第三版上讲，提取含甘油三脂较丰富的脂肪组织中的总RNA不能用一步法。可以用Chirgwin等（1979）发展，由Tavangar(1990)改进的方法。你可以查一下全文。

A micromethod for the isolation of total RNA from adipose tissue.
Anal Biochem.
作者：Tavangar K, Hoffman AR, Kraemer FB。
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过路甲[使用道具]
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发表于 2011-10-22 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我在从脂肪组织中抽提RNA前也查了一些文献，看到zhongzidegushi说的那条信息，咨询Trizol产品公司，建议用柱式RNA进行抽提，但考虑到麻烦，于是进行了一下尝试，用普通的Trizol进行抽提，并进行RT-PCR，最后电泳，结果很好，条带清晰而且没有杂带，所以普通的Trizol用于脂肪组织的抽提也是可行的
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qiangren789[使用道具]
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发表于 2011-10-22 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我提了好多次脂肪组织的RNA，其实也并不是很难！总结一下需注意的问题如下：
1 脂肪组织由于含有很高的甘油三脂和其他脂类，所以在提取的时候，所取组织的量要增加，
2 加入TRIZOL后，充分匀浆，静止，然后4度12000转离心10分钟！
3 弃取上层的油，将下层，红色的液体吸出，再加氯仿！
4 脂肪组织更易降解，除了研磨时要注意，取样时也要注意，最好是新鲜的样！
你试试吧！祝好运！
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研究僧112[使用道具]
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发表于 2011-10-22 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
终于找到同志了,我好高兴,不过我也没提出来.我用的是Qiagen 的RNeasy mini kit试剂盒,都说这个试剂盒挺好的,但我提了10次了.还是没提出来,而且我不知道该怎样去除上层的油,是直接倒掉,还是用吸头吸,我试了吸头吸,但效果不好,请高手指导一下,感激不尽.
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lgm[使用道具]
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发表于 2011-10-22 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好！首先得感谢你的热心帮助。昨日我用你介绍的方法 提脂肪组织（前日杀RAT所取脂肪）的RNA（先加入TRIZOL后，充分匀浆，静止，然后4度12000转离心10分钟！后弃取上层的油，将下层，红色的液体吸出，再加氯仿！）最终在加异丙醇后离心，EP管底可见明显沉淀，好高兴！同时提心肌RNA也见明显沉淀，但跑胶后两者均未见三条带，心肌提取物跑胶后为一条亮带，不知为何？所提物是RNA吗？沉淀用无酶水可完全溶解，如沉淀为DNA 或蛋白质，无酶水可完全溶解吗？今日用上法提-70度保存近2月的脂肪组织 提RNA，但未见沉淀 ...？？？组织取材后未放液氮仅用-70度保存，可明显影响以后RNA提取吗？请指教。非常感谢！
祝万事如意！
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发表于 2011-10-22 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各位高手、大侠
你们好!我无法从脂肪组织中提取总RNA(用Trizol法),不知能否介绍如何从脂肪组织提RNA做RT-PCR的详细步骤及注意事项，在下万分感激!
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笨鸟321[使用道具]
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 小中大
各位高手、大侠
你们好!我无法从脂肪组织中提取总RNA(用Trizol法),不知能否介绍如何从脂肪组织提RNA做RT-PCR的详细步骤及注意事项，在下万分感激!
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+田田+[使用道具]
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发表于 2011-10-22 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
若我的建议能对你有一点的帮助，我也是非常高兴的！
不过，你的实验好像还是有问题的，正常的总rna是要跑出三条带的，5s最弱，28s的亮度大约是18s的两倍，不过由于胶的问题，常常不会那么明显，在跑1％的TBE琼脂糖凝胶时，1：1就不错了，为防止跑胶时降解，可以配置MOPs胶，你可以查一下，它跑出的效果要好的多！
对了，怎么没见你提到RNA的OD值呀？正常提完都要测得，看一下比值，你的RNA是降解了，是蛋白多了就大致有数了！
我提过保存一年的脂肪组织，确实降解得很厉害，所以建议你最好用新的组织，还有我觉得脂肪组织中，脂肪滴占有很大的比例，而细胞数要比其他组织少的多，越是成熟的脂肪细胞越严重，所以，组织量要控制好！
好像也没说什么有用的，希望你能尽快得出结果！
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+田田+[使用道具]
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发表于 2011-10-22 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
加异丙醇后不会立即可见白絮状漂浮物及较多细丝线团状物形成，但是会有很多气泡！离心后才可见沉淀！我提时就是按照Trizol说明书上的步骤，没有什么特别的改动，要注意的几点我也说过了，其他象什么防止RNA酶污染等我想也不用交代的，我觉得你还是应该测一下OD值，你提的很可能是DNA，因为提DNA时会出现这样的现象！  
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