[求助]Rat的M-CSF引物设计，己知Genebank的ID。

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标题:[求助]Rat的M-CSF引物设计，己知Genebank的ID。

如影随形[使用道具]
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发表于 2011-10-24 15:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

[求助]Rat的M-CSF引物设计，己知Genebank的ID。

各位老鸟：我想做一个Rat的M-CSF的逆转录PCR，看一下骨组织中M-scf的半定量表达。查了很多原文都没有见过用大鼠做这方面的引物，Genekank中ID为NM_023981

1.for normal PCR
2.TM：55-62
3.product length：300-400bp

M-CSF ID at Genekank:
cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=31377475')

Thank you a lot!

喵咪[使用道具]
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发表于 2011-10-24 15:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

给你提供两对引物，一对靠近cDNA中间，一对稍靠后。因为NCBI上登记的MCSF序列还有比你查的长（约4kb），如果你选择的反转录酶效率不好，建议你选择靠后的引物。
1、Length of PCR Product= 354
Forward1-MCSF (1295->1313)
5'-actgaatccccaacgagtc
Tm=55.8 C CG%=52.6 MW=5741.8 19 bp

Reversed1-MCSF(1631<=1648)
5'-atgatgcctagcacccag
Tm=55.4 C CG%=55.6 MW=5468.6 18 bp

2、Length of PCR Product= 350
Forward2-MCSF (2142->2160)
5'-gccacactagcctgtatgg
Tm=57.0 C CG%=57.9 MW=5788.8 19 bp

Reversed2-MCSF(2473<=2491)
5'-tcttggcatcatgagccag
Tm=56.9 C CG%=52.6 MW=5803.8 19 bp

（如果你使用我的引物序列能做出结果，别忘了PM我，让我增加点信心呀）

如影随形[使用道具]
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发表于 2011-10-24 15:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Csf1 colony stimulating factor 1
NCBI Reference Sequences (RefSeq)

mRNA Sequence NM_023981 -----------2983bp
Source Sequence BC074007 -----------3975bp

选用上面哪个分析？
不太会用PP5.0，不过，都没分析出你提供的序列？你用的是什么软件？

谢谢大家／！

101010[使用道具]
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发表于 2011-10-24 15:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

选第一个分析。第二条是第一条的更新版，应该是比较完整的cDNAl链。
我用的是FastPCR软件，我所有的引物都用它设计，扩增都很好。括号里的数字就表示引物与序列配对的起始。

如影随形[使用道具]
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发表于 2011-10-24 15:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我看了你写的FastPcr的一个帖子，学着分析了一下，出现好多个引物序列，

问：我怎样选择最合适的一个呢？

我用PP5.0分析了一下两个你提供的引物，请看图：
好像发夹结构、二聚体、错配、交叉二聚体都有Found，不知会否影响效果？

附件

2011-10-24 15:08

31929838.gif (19.84 KB)

如影随形[使用道具]
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发表于 2011-10-24 15:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我看到这样一个，行不行？

Compatible Primers Combination: 1
>F3(1293->1311) 5'-acactgaatccccaacgag
Tm=55.4 C Tm(10)=39.5 C CG%=52.6 MW=5750.8 19 bp: PCR efficiency (quality)=91

>R7(1636<=1656) 5'-agactaggatgatgcctagca
Tm=55.3 C Tm(10)=35.6 C CG%=47.6 MW=6479.3 21 bp: PCR efficiency (quality)=80

Length of PCR Product= 364
The Optimal Annealing Temperature of PCR = 60.8 C

还是那个问题，怎么找出最合适的引物？

你说的“在序列名后输入以下文字200 600 1000 1400 (600 800)表示要求Left primer 在200－600bp之间，Right Primer 在1000－1400之间，括号内数字表示PCR产物大小的上下限。”，按你说的做了，处理出很多适合条件的引物，就是不知哪条更好点？或者，都可以做出结果来？

附件

2011-10-24 15:09

16991410.gif (19.85 KB)

椰子叶子[使用道具]
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发表于 2011-10-24 15:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不管用什么软件设计，得到合适的引物肯定都很多，我们选择时候要选评分（quality）比较高的引物对。用FastPCR设计引物时选择“Sorting primers by quality”，尽量选择排在前面的就可以了，我设计过的10几对引物都没问题。
此外还要到NCBI上看看引物是不是特异，和细菌的基因有没有同源，如果不是做人的基因还有看看和人的基因有没有同源，因为我们做实验室就算再小心也不能完全避免空气中的细菌，有时候还可能污染手上的DNA。
引物设计的其他问题DXY中有很多，你可以使用search功能（本页右上角就有）找到你要的资料。

如影随形[使用道具]
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发表于 2011-10-24 15:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

得到合适的引物肯定都很多，我们选择时候要选评分（quality）比较高的引物对

=========================================================================================

明白了，多谢。我用FastPCR，得出的那几条引物，和你做的略有差异，可能是由于设定了不同的反应条件导致的吧？

喵咪[使用道具]
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发表于 2011-10-24 15:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对于发夹结构、二聚体、错配、交叉二聚体等，我的看法是：只要连续配对的碱基不超过4个，一般对PCR影响不大。
刚开始设计引物时多数人对各种各样情况都很顾虑。其实PCR是最普通不过的技术了，随随便便都能做出来。如果能有这种想法，这对初学者无疑起到解放思想的作用，有利于实验的顺利进行。等到慢慢熟悉以后再多考虑一些引物设计优化的问题，这样可能会更合适些。

阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-10-24 15:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、您做RT－PCR检测基因表达的水平，那么您可以直接选择cDNA序列做为设计引物时的模板就可以了，我在GENEBANK找到您给的连接，在找到cDNA的连接，用下面的序列分析。
atgaccgcgc ggggcgccgc ggggcgctgc ccttcttcga catggatggg ctcccggctg
61 ctgctggtct gtctcctcgt gagcaggagt gttgccgagg tgtcggagca ctgtagccac
121 atgattggga atggacacct acagattttg cagcagttga tcgacagcca aatggagact
181 gcatgcctga tcgaatataa atttgtagac caggaacagc tggacgatcc cgtttgctac
241 ctaaagaagg cctttgtttt ggtacaagtc ataatcgagg aaaccatgcg ctttaaagac
301 aacaccccca acgccaacgc caccgagagg ctacaggaac tctctatgaa actgaacagc
361 tgctttatca aggactataa ggaacagaac gaggcctgtg tccaaactta caaagagagt
421 cctctccggt tgctggagaa aatcaagaat ttctttaacg aaacaaagaa tttccttgaa
481 aaggactgga atatttttag caagaactgc aatgacagct ttgctaaatg ctctagcaga
541 gatgtggtga ccaagcctga ttgcaactgc ctgtacccta aagccacccc tagcagcgac
601 ctggcctctg cctcccctca ccagccccct gccccctcca tggcccctct ggctgacttg
661 gcttgggatg attctcagag gacagaggga agctccctct tgcccagtga tctgcctctt
721 cgcatagagg acccaggcag tgctaagcag cgaccgccca ggagtacctg ccagaccctc
781 gagtcaacag agcaaccaaa tcacgaggac ccacaacctc atccttctgc gggggccccc
841 atccctgggg tggaagacat tattgaatct tcaatgggca ctaactgggt cttagaagaa
901 gcttctggag aggctagtga gggatttttg acccaggaaa ggaagttttc cccctccaat
961 cctgtagggg gcagcatcca ggcagagact gacagaccct gggcccgctc agcatcttct
1021 ccattcccta aattaacaga ggatcaacag ccaacgaata taacagacac cccgttgaca
1081 gaggtgaacc ctatgagacc cactggccag acactgaata atactcctga gaagacggat
1141 ggttcatcta cactgcgcga agaccagcag gagccacgct ctccccattt tgccacactg
1201 aatccccaac gagtcggcaa ctcagccacc ccctatgcta agttactgcc tcccaaaagc
1261 cactcttggg gcattgtact gccccttggg gagctcgagg gcaagaaaag tactagagat
1321 cgaaggagcc ccgcagagct gaaaggagga ccagcaagtg agggggcagc caggcctgtg
1381 gcccaaagta ctagagatcg aaggagcccc gcagagctga aaggaggacc agcaagtgag
1441 ggggcagcca ggcctgtggc ccgttttaat tccattcctt tgaccgacac aggctcttct
1501 attcaggatc cccagacctc tgcgtttgtc ttctgggtgc taggcatcat cctagtcttg
1561 ctggctgtcg ggggcctcct gttctacagt tggaagcgga ggagccatcg agaccctcgg
1621 acattggatt cttctgtggg gcgaccagag ggcagctccc tggcccagga tgaggacaga
1681 caggtggaac tgccagtgta g

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