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标题:【求助】表达的质粒已经测序确认开放阅读框内序列没问题

大大[使用道具]
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发表于 2016-4-2 12:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】表达的质粒已经测序确认开放阅读框内序列没问题

这次做原核表达一波三折，这块到最后了，又出问题了。本人用的pET-30载体，BL21菌株，IPTG诱导过后能确定诱导成功了，可是目的蛋白要比预测的小4kD左右（目的条带约55kD），用于表达的质粒已经测序确认开放阅读框内序列没问题……求解，不甚感激！
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yayayu[使用道具]
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发表于 2016-4-2 12:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

目的蛋白要比预测的小4kD左右（目的条带约55kD）如果SDS-PAGE结果的话也不能说明真的小，SDS-PAGE出来的只是表观分子量，不是真实分子量。如果不符，可以利用质谱、凝胶排阻等确认。
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mimima[使用道具]
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发表于 2016-4-2 12:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

这个质谱是不是跟分析化合物质谱差不多啊？凝胶排阻需要哪些东西啊？我们这条件有限，以前师兄师姐都不怎么做分子，所以对这方面了解较少……
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dadaai[使用道具]
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发表于 2016-4-2 12:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

有点不一样，是飞行质谱。
质谱和凝胶排阻都要蛋白纯化后做，凝胶排阻就是凝胶过滤，需要一些已知分子量的蛋白做为标准。
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燕子@[使用道具]
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发表于 2016-4-2 12:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

楼主的那个预测蛋白分子量是怎么预测啊
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malong[使用道具]
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发表于 2016-4-2 12:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

这位仁兄，你看电泳跑出的结果跟网上预测结果相差4kD~5kD,这属于正常范围吗？？？
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rrra6[使用道具]
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发表于 2016-4-2 12:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

正常，但最好别的方法验证下。
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rrra6[使用道具]
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发表于 2016-4-2 12:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

我也想验证啊，可是条件有限啊，你有什么简单易行的方法可以推荐一下吗？？？
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燕子@[使用道具]
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发表于 2016-4-2 12:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

诱导表达后马上跑电泳
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jishiben[使用道具]
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发表于 2016-4-2 12:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

Are you sure ?诱导表达做完天都黑了，在跑电泳我就要在实验室过夜了，请问诱导表达后马上跑电泳有什么理由吗?谢谢~
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