[求助]急！cDNA降解？

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标题:[求助]急！cDNA降解？

S6044[使用道具]
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发表于 2011-10-24 16:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

[求助]急！cDNA降解？

我做的普通半定量pcr，条件已经做得很成熟了，条带扩的很清晰。不知道为什么最近1个月扩出来都有长长的象彗星尾似的拖带，目的条带很不清晰。双扩：actin条带好，我一共扩了4个目的基因，其中3个就象上面说的那样，只有一个基因条带仍然很亮。我以为是引物除了问题，又把一个主要的目的基因引物重新合成了一下，扩出来还是那样，真是给气得要命。我做的是原代细胞提取rna，RT-PCR，千万不要是cdna出了问题？或者有没有可能是酶、dntp、10*buffer、mgcl2之一或者是那个环节除了问题哪？天哪，我已经没辙了，哪位高人赶快现身指点一下吧！多谢了！

S6044[使用道具]
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发表于 2011-10-24 16:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我今天又用别人的cDNA模板（也强表达我的目的基因）+我的全套PCR试剂//我的原来扩的比较好的模板+别人的全套PCR试剂（除了引物是我刚刚重新合成的）做了两次，结果两份表达都弱弱的，和我原来扩的强度完全没法比较，这到底是怎么会事哪？哪位打下帮帮忙吧

阿凡提[使用道具]
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发表于 2011-10-24 16:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可能是引物反复冻融,发生变性.

S6044[使用道具]
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发表于 2011-10-24 16:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也怕是这样：（
但是用同样的模板扩其他的目的基因，有一种目的基因可以扩的很亮的；又用别人比较好的模版（强表达我的那个目的基因）+我的新合成的引物（用的是原来的序列）扩出来，条带也很弱，这又应该怎么解释呢？

按秒计算[使用道具]
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发表于 2011-10-24 16:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

引物合的量够不够，有时合的量不够浓度低，扩增效率也不高。你可以检测一下。

S6044[使用道具]
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发表于 2011-10-24 16:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

担心是模板的问题，我昨天吧原来的RNA拿出来重新反转录，所得CDNA扩我所做的4个目的基因和ACTIN，结果如下：
ACTIN和我另外的3个目的基因都扩的很亮，只有我主要的那个目的基因弱弱的一条带，还有长长的拖尾。反复做了几次都是这个样子。
如果象angelageng所说，引物的量不够，可是我以前都扩的相当稳定呀，条带非常亮，和ACTIN的亮度差不多。如果是CDNA摸板活性降低，可能需要增加引物的量或者重新调整其他条件，但是看其他基因扩的情况，又好像不是模板的问题？？？？？？？
有没有可能是引物的问题呢？这个引物序列我原来（3-8月份）扩的非常好，9月份开始出问题，相同的摩板、PCR条件条带非常弱，我又用这个引物序列去重新合成，这一段时间扩出来还是那个样子，会不会是这次合成的引物有问题呢？？？？？？
一头雾水，急需帮助！

PINK[使用道具]
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发表于 2011-10-24 16:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不知你用多大体系，如果小的话，可以放到50ul试一下
同时可以减少一点模板试试

S6044[使用道具]
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发表于 2011-10-24 16:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的是25ul体系，目的基因引物(25pmol/ul)是上下游各0.5ul，华美taq酶0.4ul，dntp0.5ul,mgcl2 用1.5ul.
pzx2004 的意思是不是说50ul的体系更稳定，试剂之间能够更加充分的发生作用？
另，为什么要减少模板呢？我本来还想增加一下模板试一下呢？
急盼回复,谢谢

椰子叶子[使用道具]
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发表于 2011-10-24 16:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

体系越小就越难控制，越不稳定
我不知道你加多少模板，模板过多反而会抑制PCR，特别是反转录的未纯化产物

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发表于 2011-10-24 16:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我模板用1.5ul,没有纯化

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