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标题:[求助]请教PCR的热启动法

she[使用道具]
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发表于 2011-10-24 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]请教PCR的热启动法

[求助]请教PCR的热启动法


前段时间PCR莫名其妙的跑不出东西，后来在丁香园里看到有人说在加酶之前先将加有模板的体系在95度变性10分钟。我的做法是将体系和 模板都分装到小管里（25ul体系）95度变性10分钟，之后拿出在冰盒上向小管加酶0.2ul,再PCR：94度30秒、退火30秒、72度30秒，35个循环，72度10分钟，4度3分钟。结果有条带出现。我不知道我的方法对不对，这是不是符合热启动法，因为我今天看到有一种热启动Taq酶，不知道热启动法是不是一定要用这种酶！  
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wawa[使用道具]
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发表于 2011-10-24 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
实际上，热启动法主要是想去掉不特异性的产物，也就是防止在从室温到95度过程中的Taq的活性。你的做法没有什么问题，不过太麻烦了，直接不加酶的体系变性就可以了。Taq酶没有什么要求
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发表于 2011-10-24 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
基本没有问题，可以再试试加酶的时候不放在冰上，不然加了酶后又要升温，还是和你以前的做法一样啊，相对只是增加了变性时间。
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发表于 2011-10-24 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的做法不是Hotstart，热启动要在维持高温度的情况下加入酶。  
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饭团团[使用道具]
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发表于 2011-10-24 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.热启动本来的目的是为了减少一些非特异带.
2.你PCR设的程序没什么问题.
3.10分钟变性以后,不要把反应液拿出来放在冰上,如果这样,你的热启动就等于没意义了.
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发表于 2011-10-24 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果你的money允许，买点热启动酶，Applied Biosystems的金牌taq酶。
我在做巢式PCR时，第一轮产物用普通taq酶是扩增不出来的，换了金牌酶就可以扩出来，效率还是不错的！优点是：
自动热启动增加了特异性和产率
无非特异性产物，便于检测低拷贝模板  
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荒漠孤驴[使用道具]
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发表于 2011-10-24 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
买点石蜡油就可了
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she[使用道具]
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发表于 2011-10-24 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果使用了热启动酶是不是就不用分两步做，一开始就直接把酶加进去就可以了？
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发表于 2011-10-24 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
热启动酶很贵的！热启动实际就是降低配置反应体系好，到94C变性之间Taq酶的活性，你可以减少期间的时间，并按照你的做法，尽快PCR；
热启动酶实际上就是用石蜡一类的材料将酶包裹，只有94C 10min后石蜡溶化将酶释放到反应体系后，Taq才得以碰到模版，PCR才开始

对，楼下山青水秀 说的是
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jkobn[使用道具]
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发表于 2011-10-24 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
热启动酶实际上就是用石蜡一类的材料将酶包裹，只有94C 10min后石蜡溶化将酶释放到反应体系后，Taq才得以碰到模版，PCR才开始

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好象并非如此吧，应该是将酶的结构经过化学修饰的。
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