【求助】甲基化特异性PCR的修饰问题

最新回复

• yes4 (2016-4-07 10:36:59)

  我都是用Sigma的sodium bisulfide及hydroquinone 修飾我的DNA建議你用的純度高一點或是覺得MSP不好做也可改用COBRA(Comined Bisulfite Restriction Analysis)以bisulfide修飾後PCR amplify 後再以酵素切能切動即是有甲基化(Nucleic Acids Research, 1997, Vol. 25, No. 12 2532–2534)

• u76mp (2016-4-07 11:21:00)

  野生型引物能扩出条带来，是因为甲基化修饰不完全，修饰后的DNA中有野生型的DNA 。在进行MSP时往往要采用热启动PCR,使双链DNA充分解链，仅其中的一条链作为模板进行扩增。

• 小荷尖尖 (2016-4-07 11:23:14)

  
  先谢谢你, 我正准备换用Sigma的产品,但又觉得同样是分析纯,国产试剂(新买的)应该可以修饰,即使是修饰的不完全,M或U引物也应有条带,我是完全按照Current Protocols in Human Genetics(1998) Herman 提出的方法做的，有用这个方法的同胞吗？是不是这个方法做msp 很难！马上要交课题总结了，急死我了！

• 33号 (2016-4-07 14:16:58)

  
  实在是劝你改用现成的试剂盒，如chemicon公司的，效果很好，价钱也不算贵，3000左右。可以做几十例呢，我们一直在用，到目前为止已经用到第三盒了。

• 小荷尖尖 (2016-4-07 14:21:01)

  我用手工修饰的纯化试剂也很贵,要是做不出什么就换试剂,我怕过不了老板这一关呀!我相信别人用这种方法能做出来,我的试验不知是哪个环节出了问题!

• DDD (2016-4-07 14:21:26)

  我用的是chemicon公司试剂盒，可一直做不出来，请教楼上你的PCR体系是多少？修饰前后DNA量有多少？能否把你的protocol传一份给我，急啊，老板催!

• boom (2016-4-07 14:26:18)

  你的问题确实有修饰不完全的因素存在。建议：
  1、重新修饰。降低修饰的DNA的量（1-2ug就可以了）；提高修饰的温度，约提高5度左右；也可以增加修饰的时间。当然能用试剂盒就更好了。
  2、“如果修饰不完全，至少应该有少量的目的片段被修饰，这样以这些少量的DNA为模板，应该M或U引物也应该有条带呀？” 你所说的这个也很有道理的，所以你可以优化你的PCR，建议提高你的退火温度，延长退火与延伸时间（可以用45s--60s）

• 小荷尖尖 (2016-4-07 14:31:49)

  
  有个问题不明白，我看到不同的实验室用的亚硫酸氢钠的浓度不同，我是按HERMAN提出的2.6M的终浓度，有人用3.3M，还有用更高浓度的，我用的是国产的试剂，而HERMAN用的是SIGMA的试剂，想请教你1、亚硫酸氢钠、氢氧化钠和醋酸铵的终浓度用多大量合适？
  2、醋酸铵的作用是中和反应体系中的碱，还有作为沉淀反应的盐，那么该如何确定其用量呢？
  3、氢氧化钠再修饰的过程中用到两次，第一次起变性作用，机理是什么（怎么变性）？第二次是脱磺基作用，反应式是什么？
  我想调整我的试验，但又不明白其中的细节，希望做甲基化的朋友能踊跃参加讨论，不知道在哪能找到这方面的知识？请大家给个提示！

• 9900 (2016-4-07 14:32:17)

  
  我用的也是chemicon公司试剂盒，一直做不出来，试剂都快用完了还没有结果．郁闷呀．tjmedwnn，你能传一份你的protocol给我吗．感激不尽！！

• 33号 (2016-4-07 14:57:25)

  帮小弟一把，我做了很长时间了，可就是不知道哪里出问题了。会不会是chemicon的试剂有问题啊，请教tjmedwnn 你的PCR体系是多少？修饰前后DNA量有多少？能否把你的protocol传一份给我

• cj_mondy (2016-4-07 14:58:39)

  我觉得PCR体系倒不是重要的啊，操作就是照试剂盒的说明书一样啊，你先说说你的问题所在吧，是PCR扩后没带还是什么啊，你确定你的标本就一定是甲基化标本吗？

• wiwi (2016-4-07 14:59:00)

  我现在用的是细胞系做的Raji,Hela。文献上Raji是甲基化的，我做出来有很多非特异带，没有目的带（应该是100bp左右）。我的引物是文献上的，在做的过程中有什么需要特别注意的

• SO2 (2016-4-07 15:02:19)

  你可以试一下做一个梯度PCR，从文献的退火温度向上下各5度
  还有就是你在加DNA模板的时候千万主意不要加进去沉淀（就是试剂III），另外不知道你在修饰的时候加试剂IV了没有啊，没有就最好加一下。

• xueyouzhang (2016-4-07 15:04:18)

  我做过梯度，试剂IV不是要样本量不足时才加吗？我的DNA量够，所以就没有加，
  是否应该在用ＴＥ溶解后，再离心使试剂III沉淀后吸取。
  我试试，回头告诉你结果

• 33号 (2016-4-07 15:04:32)

  你的结果怎么样了啊？

• chenshuanhe (2016-4-07 15:05:50)

  
  已经看到有目的条带大小的条带出来了，我想应该是吧，但是非特异的杂带也很多，今天重复设了模板和温度梯度可是目的带没有了，不知是怎么回事

• 101010 (2016-4-07 15:06:23)

  
  给上面的朋友推荐一个好的实验方法论坛 protocol online论坛: 是美国华人所办，版主都是美国实验顶尖高手。有许多实验中的疑难问题的解决方法。尤其是甲基化实验。
  cuturl('http://www.protocol-online.org/forums/index.php?showforum=6/')

• 131415 (2016-4-07 15:07:05)

  
  我也正在准备这个实验，国外师兄推荐的这个MSP的方案值得参考。他是一次就成功的。
  cuturl('http://www.mdanderson.org/departments/methylation/dIndex.cfm?pn=A3F15D82-C9B4-41CD-BA4BE767E50A73D2')

• SO2 (2016-4-07 15:07:31)

  
  我知道这个网站，上面的protocol是手工修饰，我用的是试剂盒，昨天做出来的结果不错，带清晰背景干净，但是非甲基化也有大小相似的带出来（样本是甲基化的），怎么回事？

• 33号 (2016-4-07 15:08:18)

  
  我还没有完全明白，不过这里到是有这样的结果。文章见
  cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=1623846&sty=3&keywords=%BC%D7%BB%F9%BB%AF')
  下面附件中标记处
  这里的解释是标本4-6中既含有甲基化的等位基因，也含有未甲基化的等位基因。我的理解是标本的DNA经亚硫酸盐不完全处理，因为对于某一个个体的DNA，他/她的基因是否甲基化和/或甲基化的水平在一定情况下（比如你已经取到的标本中）是一定的。希望战友再给出确定的解释。