固相萃取

来园子里也有好多年了，学到了很多东西，但一直没有贡献，这让我有些愧疚。现在，特将我总结的体内小分子化合物分析过程中的制备技术贡献出来，以此回馈园子，望各位园友觉得对的就鼓励一下，觉得不合适的就提醒一下，在此先谢谢了：）
另，本人对此文拥有原创版权，如各位园友需要引用，请加上链接。本文之所以以此方式推出而非整个文档一起推出是想更好的得到大家的帮助，共同讨论，最后我会结合大家的意见整理为一个文档，奉献给大家：）
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本文的目录如下：
表格目录 7
图目录 9
1. 前言 12
2. 样本分类及采集 12
2．1 生物样本分类 12
2．2 生物样品采集 12
2．2．1 血样 12
2．2．1．1 组成 12
2．2．1．2 血浆及血清 14
2．2．1．3 全血 15
2．2．1．4 溶血 16
2．2．2 尿样 17
2．2．3 唾液（saliva） 17
2．2．3．1 唾液组成 17
2．2．3．2 唾液采集 18
2．2．3．3 唾液样品的优缺点 18
2．2．3．4 STDM现状 19
2．2．4 不均匀样本的采集 20
2．2．5 呼气的采集 21
2．3 样本前处理所用仪器 21
2．3．1 离心机 21
2．3．1．1 离心技术 21
2．3．1．2 离心力换算 21
2．3．1．3离心机的主要构造和类型 22
2．3．1．4 制备性超速离心的分离方法 25
2．3．1．5 离心操作的注意事项 27
2.3.2 移液枪 28
3. 初步处理 31
3．1 血样 31
3．1．1 血浆的初步处理－抗凝 31
3．1．2 血清的初步处理 32
3．1．3 絮状沉淀物 32
3．2 尿样防腐剂 33
3．3 生物样品稳定剂 33
3．4 生物样品的储存 33
3．4．1 挥发 36
3．4．2 储存容器的选择 36
3．4．3 大气中的气体吸收 37
3．4．4 化学变化 37
3．4．5 不稳定固体的保存 37
3．5 去蛋白处理 37
3．5．1 有机溶剂沉淀蛋白 38
3．5．2 加入酸性沉淀剂 38
3．5．3 加入无机盐类 39
3．5．4 加入重金属盐类 39
3．5．5 总结 39
3．5．6 组织酶消化法 40
3．6 结合物水解 41
3．6．1 酸水解 41
3．6．2 酶水解 41
3．6．3 溶剂解 42
3．7 膜技术与体内药物分析 42
3．7．1 膜技术概况 42
3．7．1．1 定义及历史 43
3．7．1．2 分类 44
3．7．1．3 膜分离原理 45
3．7．1．4 膜分离特点 46
3．7．1．5 膜分离过程 47
3．7．2 膜技术在样本制备中的作用 47
3．7．2．1 微孔滤膜过滤杂质 47
4. 游离药物分离 51
4．1 游离型、结合型药物及药物血浆蛋白结合率 51
4．2 游离血药浓度测定方法 53
4．2．1 平衡透析法(equilibrium dialysis) 53
4．2．1．1 简述 53
4．2．1．2 原理及方法要点 54
4．2．1．3 影响因素 56
4．2．1．4 常用计算方法及应用实例 58
4．2．2 超滤法（ultrofiltrition） 61
4．2．2．1 超滤法原理 61
4．2．2．2 超滤法要点 61
4．2．2．3 影响因素 62
4．2．3 凝胶过滤法（gel filtration） 62
4．2．3．1 原理 62
4．2．3．2 方法要点 63
4．2．4 超速离心法（ultracentrifugation） 63
4．2．5 白蛋白微球测定法（bingding to albumin microsphere） 64
5. 萃取技术 65
5．1 概述 65
5．2 样本制备的不确定度 66
5．3 方法效率及其确证 67
5．4 萃取原理 67
5．4．1 挥发性 68
5．4．1．1 Henry’s Law Constant 68
5．4．1．2 蒸汽压 68
5．4．1．3 溶解度 69
5．4．2 疏水性 75
5．4．2．1 疏水性 75
5．4．2．2 疏水性和水溶解度 77
5．4．2．3 氢键和范德华力 79
5．4．3 酸碱平衡 81
5．4．3．1 平衡公式 81
5．4．3．2 常见溶剂的解离常数 83
5．4．3．3 酸碱定义 87
5．4．4 疏水性可电离化合物的分布 88
5．4．5 介电常数 89
5．4．5．1 简介及静电学基本定律 89
5．4．5．2 介电常数 90
5．4．5．3 电极化强度 93
5．4．5．4 极化的微观描述 94
5．4．6 极性 95
5．5 液液萃取 95
5．5．1 概述 95
5．5．1．1 混溶性 (Miscibility) 96
5．5．1．2 密度 (density) 97
5．5．1．3 溶解度 (Solubility) 97
5．5．1．4 各类溶剂的互溶性规律 - 100 -
5．5．2 影响萃取的各种因素 - 103 -
5．5．2．1 空腔作用能EAq-Aq和ES-S - 103 -
5．5．2．2 离子化水作用 - 105 -
5．5．2．3 亲水基团作用 - 105 -
5．5．2．4 丧失亲水性作用 - 108 -
5．5．2．5 溶剂氢键作用 - 109 -
5．5．2．6 离子缔合作用 - 110 -
5．5．3 回收率 - 111 -
5．5．4 萃取方法 - 112 -
5．5．5 三相萃取 - 114 -
5．5．5．1 乳液膜 - 114 -
5．5．5．2 固体支持液体膜 - 115 -
5．5．5．3 反相胶束萃取 - 115 -
5．5．6 解离萃取（Dissciation Extaction） - 115 -
5．5．7 液液萃取技术的进展 - 116 -
5．5．7．1 微管－纤维化玻璃芯片LLE - 116 -
5．5．7．2 固体支持LLE - 117 -
5．6 液固萃取 - 118 -
5．6．1 简介 - 118 -
5．6．2 吸附 - 119 -
5．7 固相萃取（SPE） - 119 -
5．7．1 简介 - 119 -
5．7．2 固相萃取剂的种类及其机制 - 120 -
5．7．2．1 极性吸附剂 - 121 -
5．7．2．2 非极性聚合树脂 - 123 -
5．7．2．3 键和相硅胶 - 123 -
5．7．2．4 球形碳吸附剂 - 126 -
5．7．2．5 功能性聚合树脂 - 127 -
5．7．2．6 离子交换树脂 - 130 -
5．7．2．7 控制通路树脂 - 138 -
5．7．2．8 免疫亲和吸附剂 - 139 -
5．7．2．9 分子内嵌聚合吸附剂 - 139 -
5．7．3 吸附剂的选择 - 140 -
5．7．4 回收率的优化 - 141 -
5．7．4．1 样本pH值 - 141 -
5．7．4．2 上样量 - 142 -
5．7．4．3 吸附剂质量 - 142 -
5．7．4．4样本浓度 - 143 -
5．7．4．5 洗脱溶剂强度 - 143 -
5．7．4．6 洗脱溶剂体积 - 144 -
5．7．4 固相萃取技术的应用 - 144 -
5．7．5 固相萃取过程特点 - 147 -
5．7．5．1 离子化化合物 - 147 -
5．7．5．2 自动化 - 147 -
5．8 固相微萃取技术（SPME） - 147 -
5．9 加压液相萃取（Pressurized Liquid Extraction, PLE） - 150 -
5．9．1 简介 - 150 -
6. 萃取后过程 - 151 -
6．1 萃取样品的浓缩 - 151 -
6．2 样本净化 - 151 -

样本前处理技术在体内药物分析方法中占有极其重要的地位，很多分析问题都可以通过样本前处理解决，本文将对样本前处理过程中遇到的问题和样本前处理方法进行综述，以期形成一个系统。
本文将分为样本分类及采集，初步处理，游离药物分离，萃取技术、萃取后过程五个部分进行分别阐述。

2.  样本分类及采集

2．1 生物样本分类

生物样本多种多样，有血浆、血清、全血、淋巴、唾液、各种组织、毛发、尿液、胆汁、泪液、脊髓液、汗液、乳汁、羊水、粪便以及呼出的气体。（以下文字主要摘自《体内药物分析》姚彤伟编著 2001年）生物样品可大致分为①均匀样品：血液、尿液、唾液、胆汁、脑脊液、淋巴液、乳汁和性腺分泌液等体液；②非均匀样品：心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、生殖器官、脑、体脂、胸腺肾上腺和骨骼肌等11种器官、组织。Ruth Endacott总结了临床样本采集时需要注意的问题以使采样够用和适用 。

2．2 生物样品采集

2．2．1 血样

2．2．1．1 组成

血样包括血浆、血清和全血，其中最常用的是血浆。一般认为，药物在体内达到稳定状态时，血浆中药物浓度是与药物在作用点的浓度紧密相关的，即血浆中药物浓度可以反映药物在体内(靶器官)的状况，而且血浆中药物浓度的数据报道较多，可供借鉴。

欲借助血药浓度来了解药物体内的转运规律和用于剂量调整, 应待药物在血液中分布均匀后再取样。直接抽取动脉血或自心脏取血无疑是最理想的方法，因为动脉血中的药物已充分混匀，但此法仅适用于动物实验研究。就采血方式而言，目前使用较多的方法是自静脉采血，并且视采血次数的多少和实验方法需要，一般每次采血1－5ml。做动物实验时，采血量不宜超过动物总血量的十分之一，以免因血流动力学改变而影响研究结果。表1列出常见动物的采血方法。标准的犬类或猫类动物收集血样方法参见Lucas RL 的综述。血样储存及储存条件参见下图1。

1： Endacott R, Botti M. Clinical research 3: sample selection. Intensive Crit Care Nurs. 2005 Feb;21(1):51-5. See A-I-21
2：Lucas RL, Lentz KD, Hale AS. Collection and preparation of blood products. Clin Tech Small Anim Pract. 2004 May;19(2):55-62 A-I-20
3：《体内药物分析》姚彤伟编著 2001年 p45

2．2．1．2 血浆及血清

血浆(plasma)的取得是在加肝素、草酸盐、枸橼酸等抗凝剂的全血经离心后分取上层清液，其量约为全血的一半。血清(serum)则是由血液中纤维蛋白原等影响下引起血块凝结而析出，离心后取上层清液而得，血块凝结时，往往易造成药物吸附的损失。通过制备后的血清一般可以得到全血的40%，而血浆会比血清多，大约占全血的50％，个体差异较大 。

血清和血浆有以下三点区别：1。 血清中没有纤维蛋白原 2。 血清中无参与凝血机制的血浆蛋白 3。 血浆无一些凝血过程中血小板释放的物质。

在药代研究中两者各有优缺点：
1. 血浆中含有抗凝物质（肝素或EDTA），可能会干扰化合物的检测（结合等），血清则无。
2. 血浆中蛋白稍多，可能会在SPE中产生诸如堵柱子等情况，干扰样本制备过程（这一点其实差别不明显）。
3. 血浆制备快速，直接低温或常温离心后即可分离，血清制备耗时较长。这一点对药代试验影响较大，因为给药后4小时内一般取血点都较为密集。
但血清分离胶的出现可解决这个问题，详见本书3.1.2节。
4. 血清的凝血过程可能会因为与药物产生吸附作用，从而减少血清的含量，并且有可能造成浓度不平行现象。
血样采取量受到一定限制，尤其是连续取样时，病人感到负担，不易得到配合。血样一般每次取1-5mL，但随着高灵敏度测定方法的建立，取样可少到0.1-0.3mL，可改用手指取血，从而易为受试者接受。

2．2．1．3 全血

全血(whole blood)也应加入抗凝剂混匀，防止凝血。
对大多数药物来说，血浆浓度与红细胞中浓度成正比，全血不能提供更多数据，全血药物浓度往往不能很好反映药物的药理作用强度，不能作为作用部位药浓的可靠指标。常选用血浆或血清进行体内药物分析，其原因如下：

1. 血细胞中药物暂时仅作为药物“储库”而失去药理作用，不是反映作用部位药浓的改变，因而不能与药效建立相关关系。

2. 血细胞密集现象。有一些药物如米帕林，它主要集中于白细胞内，只要有生理病理因素导致白细胞增加，就会引起全血药物浓度相应升高，其全血药物浓度变化仅反映白细胞数量的改变，而不是反映作用部位药浓的改变。有些药物(如氯噻酮)可与红细胞结合，其动力学行为与在血浆中不同。

3. 全血净化手续较烦、尤其是溶血后，血色素等可能会给测定带来影响。

但有时必须使用全血进行体内药代动力学研究。在如下情况下，需要使用全血进行PK研究：

1. 如环孢A广泛分布于血液各成分中，已采集的血液样品内CsA在血浆、单核细胞和红细胞中的分布会随室温发生变化，见表3。

温度升高后CsA自红细胞中释放量增多，血药浓度上升，因此抗凝血离心分离血浆过程中，室温对血浆药浓就有影响，并且难以控制。抗凝血即使在同一室温条件下，不同时间离心的血浆中CsA浓度亦有变化，在0－1hr内药浓逐渐降低，1－3小时才恒定。另外，由于CsA有效血药浓度较低，并且药物又大量分布于血细胞中，因此血浆/血清测定其浓度时，达不到仪器检测灵敏度要求。鉴于上述原因，在进行CsA PK研究时就常使用全血样品，而不用血浆或血清。

2. 有时作药物筛查时也会使用全血样本。

全血样品是由血浆和血细胞（包括抗凝剂）组成，是非均匀溶液，测定时必须使血细胞破裂（如测定CsA时加入氢氧化钠，超声或冻融）使之成为均匀溶液。

表格 3 环孢霉素在血液中的分布随着温度变化情况

全部缴公了......因为这个文件确实费了我不少心血，并且最近查文献消耗丁当太多，所以下载一次索要2个丁当，稍微补偿一下。

谢谢LZ！胆石我看了下为什么没有胆结石的样本处理呢？

已知杂质对照品（异构体）与主峰（对照浓度与供试品溶液中主峰相差500倍）下分离很好，分离度分别为3.21，2.13，均大于1.5，但是当有关供试品溶液中加入杂质对照品后，在这个浓度下，分离度就小于1.0；换句话说，在供试品溶液中杂质的两个异构体无法和主峰完全分离，这种情况下色谱条件还要再进一步优化吗？如果无法再分离的话这样的方法可行吗？

需要进一步优化。
无法分离的话，方法不可行。
ps：楼主实用c18柱吗？异构体的话，c18是很难分开的！

不是普通色谱柱，是手性柱，所以优化的空间相对较小。