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标题:【求助】总RNA提取

yysr238[使用道具]
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【求助】总RNA提取

我最近在提取肝细胞和心肌细胞的总RNA,肝细胞是用骨髓干细胞诱导的
提取方法是用trizol提取
大致的步骤是:
1.在1个六孔板中加入1ml,trizol,吹打,吸取液体到EP管中。
2.加200ml氯仿,震荡30s,放置3min。
3.离心15min,10000rpm。
4.取上清加入等体积异丙醇。
5.离心10min,11000rpm
6.倒掉EP管中液体,加入75%乙醇。
7.离心5min,7500rpm
放在超净台中,鼓风干燥
加入10ul,depc水
然后取2UL,稀释到500ul,放在紫外中检测,检测结果260/280比值在1.3左右
但是电泳结果,三条带都有的,背景也是比较干净的
不知道260/280的比值这么低是什么引起的,需要怎么解决,谢谢大家的帮组!
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9900[使用道具]
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和我成功提取的各步骤进行对比分析:
1. 加trizol前PBS是否洗涤,去除死细胞
2. 震荡时避免应用斡旋振荡器,以防破坏RNA全长
3. 4度离心15分钟,12000g/分
4. 取上清(一定要小心,避免枪头碰到下面白色层)
5. 4度离心10分钟120000g/分
6. 上下颠倒使rna块悬浮,洗涤rna块
7.离心5min,12000g/分离心
8.倒掉EP管中液体,一般情况下,放置一会,肯定会有较多剩余乙醇,小心用枪头吸出,用不着非得等到干燥(个人意见)。
9加30ul DEPC水稀释
你的OD值低,是不是第4步吸上清时碰到白色层,受到蛋白质污染了
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yysr238[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 9900 于 2016-4-9 10:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

和我成功提取的各步骤进行对比分析:
1. 加trizol前PBS是否洗涤,去除死细胞
2. 震荡时避免应用斡旋振荡器,以防破坏RNA全长
3. 4度离心15分钟,12000g/分
4. 取上清(一定要小心,避免枪头碰到下面白色层)
5. 4度离心10分钟1200 ...

不会的,我吸取上清的时候每次都是贴着壁下去的,而且每次都省一点没有吸取。
我估计是不是我浓度太低的原因,请问你测的时候浓度都是多少。
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9900[使用道具]
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原帖由 yysr238 于 2016-4-9 10:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不会的,我吸取上清的时候每次都是贴着壁下去的,而且每次都省一点没有吸取。
我估计是不是我浓度太低的原因,请问你测的时候浓度都是多少。

我一般不会贴壁吸上清的,因为我发现离心完之后,中间白色层会贴壁很高,很容易就碰到,所以都选择在液面中间吸
我的浓度一般是1ug/ul左右
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yysr238[使用道具]
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原帖由 9900 于 2016-4-9 10:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我一般不会贴壁吸上清的,因为我发现离心完之后,中间白色层会贴壁很高,很容易就碰到,所以都选择在液面中间吸
我的浓度一般是1ug/ul左右

谢谢,我今天按你的方法提了一下,发现260/280的比值是上去了,但是好像浓度很低啊
大概只有0.1ug/ul的样子!
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浓度低会不会是细胞量变少的缘故呢?我在做的一个药物浓度大时对细胞生长有影响的,结果在提RNA的时候白色沉淀几乎看不出来!而阴性对照组和低浓度组就是肉眼可见的白色沉淀。测RNA浓度发现药物浓度大的那组浓度也是十分低的。我想,会不会是你PBS洗涤时损失了很多细胞?因为本来六孔板中的一空也长不了多少细胞。你可以每组养两孔试试,或是直接用培养瓶养
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yysr238[使用道具]
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谢谢啊,现在提取的RNA 260/280,已经符合要求了,但是浓度依然很低,260/230比值还是比较低的,我想问一下,你们一般6孔板能提取多少RNA
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蛋白污染了
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1 单纯说6孔板信息是不全的,你的细胞长满一个6孔板的密度有多少决定了总RNA的多少。
2 RNA得量过少不排除提取过程中被降解的情况。防止RNA酶污染的方法是:
(1) 尽量用DEPC水浸泡可能用到的所有EP管,镊子,枪头等
(2) 提取过程中勤换手套,薄膜手套效果差,最好用橡胶手套。
(3) RNA酶除了存在于皮肤上等,还有说话唾液等,尽量少开口。
(4) 再次核实到底6孔板长满时有多少细胞量。
3 OD值低的原因上面战友说了很多,再提几点
(1) 关键步骤一:加氯仿后颠倒混,不要用涡旋振荡但要用手用力颠倒。
(2)关键步骤二:4度,20分钟离心的那步其实最关键。
祝你顺利!
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9900[使用道具]
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用DEPC水溶测得的比值比较低,用TE(ph=8.0)溶RNA所得的比值可以高一些,提得好的化可以达到1.9~2.0
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