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标题:【求助】关于抗体电荷异构体之间是否存在相互转化问题

TAT[使用道具]
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这个问题略久了,首先感谢各位战友的积极回答。 对于这个课题,后续又做了一些研究。 本人经过脱K之后发现,碱性峰比例相应减少(仍存在),而酸性第一个峰的比例明显上升,表明此酸性峰中确由碱性峰的一个成分脱K而来,另外碱性峰中并非只是一个翻译后修饰导致,而是一个混合物。对于是什么导致的翻译后修饰,样品正在送检打质谱,待日后再讨论。
ylhuang0502 说得现象以及文献我之前也有阅读过,因为我这里是纯化,用的制剂纯品,并不涉及培养液中的铜。
为了得到足够纯的样品,将第一次纯化的再重复分离,样品纯度上升不少,,但依然存在上述的现象。 将碱性组分一直往后收集,收集完不浓缩,直接分析,仍能见到约有10%的主峰。这个现象也说明,酸碱性质相近,在这样的分离条件下,(HPLC,WCX-10柱子)不能完全分离。
综上,出现最开始的情况,两种因素都存在,分离效果不佳以及转化问题。
......

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又看到楼主的图谱了,仔细看了下,第1个碱性峰是单K,第2个碱性峰是双K,一般要求仿制药是第1个碱性峰的含量大于第2个碱性峰的,楼主的含量反过来了,我们现在也遇到这个问题了;另外,又遇到个大问题:放大到50L时,碱性成分增到了20%,以前做的小试研发工艺是除去酸性成分后碱性是符合要求的,现在碱性占的比例变大,就不好办了,酸性成分比碱性成分好处理,现在还得重新研究工艺除去碱性成分,希望上游放大到100L又出现了新的酸碱比例。
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又看到楼主的图谱了,仔细看了下,第1个碱性峰是单K,第2个碱性峰是双K,一般要求仿制药是第1个碱性峰 ...

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国内单抗研究的通病,不必说细胞株,也不必说培养基,单是短短的培养工艺一带,就有无限的问题。
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lz,保留时间校过的吧?看到那条红线了。
1个K,2个K的峰,应该是能轻松分开的,lz梯度可以再优化。
PGK,P Amidated的一样导致碱性峰。
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又看到楼主的图谱了,仔细看了下,第1个碱性峰是单K,第2个碱性峰是双K,一般要求仿制药是第1个碱性峰的含量大于第2个碱性峰的,楼主的含量反过来了,我们现在也遇到这个问题了;另外,又遇到个大问题:放大到50L时,碱性成分增到了20%,以前做的小试研发工艺是除去酸性成分后碱性是符合要求的,现在碱性占的比例变大,就不好办了,酸性成分比碱性成分好处理,现在还得重新研究工艺除去碱性成分,希望上游放大到100L又出现了新的酸碱比例。

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图谱看的不是很清楚。第一个第二个碱性峰是不是含K的峰要看CPB酶切之后的结果的,有可能第一个峰是P-amidated的峰,第二个碱性峰才是1k,而2K则很小。所以也有可能第二个碱性峰高于第一个碱性峰。我们做的就有这样的
另外说到放大后的酸碱比例出现变化我们也经常碰到,酸性峰还可以通过后期纯化降低,碱性峰就有点困难,我们当时碰到的问题就是1K的峰太高,导致件碱性峰一直超标
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lz,保留时间校过的吧?看到那条红线了。
1个K,2个K的峰,应该是能轻松分开的,lz梯度可以再优化。
PGK,P Amidated的一样导致碱性峰。

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弱弱的问下,PGK和P Amidated具体代表什么意思?
我的理解是磷酸甘油酸激酶和脱酰胺,对吗?
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lz,保留时间校过的吧?看到那条红线了。?1个K,2个K的峰,应该是能轻松分开的,lz梯度可以再优化。?PGK,P Amidated的一样导致碱性峰。?
弱弱的问下,PGK和P Amidated具体代表什么意思? ?我的理解是磷酸甘油酸激酶和脱酰胺,对吗?

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你是真可爱还是逗我们的玩的,看文献之前做蛋白要懂序列的,PGK是C末端的三个氨基酸缩写,另外一个东东是缺失GK,P氨基酸被amidated了。
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BUK[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 BUK 于 2016-4-13 12:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
lz,保留时间校过的吧?看到那条红线了。?1个K,2个K的峰,应该是能轻松分开的,lz梯度可以再优化。?PGK,P Amidated的一样导致碱性峰。?
弱弱的问下,PGK和P Amidated具体代表什么意思? ?我的理解是磷酸甘油酸激酶和脱酰胺,对吗?

= ...

好吧,关于PGK我想多了
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国内单抗研究的通病,不必说细胞株,也不必说培养基,单是短短的培养工艺一带,就有无限的问题。

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我赞同你的观点,发现做发酵的根本不懂发酵,出现问题后,发酵人员和所谓的海龟工作15年大领导提出的解决方法真是笑死人,完全不是在理论之上的,最后看不下去了,我们做纯化的才给他们提出解决方案,唉,悲哀啊
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类似的事我们见多了,很多海归都这样,真正懂的还是牛的,但是很多所谓的大海龟就根本不懂工艺,只是做过研究而已。或者贬低做工艺人员的价值,天天吹牛自己多创新。
细胞培养工艺是个大学问,抗体纯化上很多问题不好解决,培养上小道道太多了。
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这个话题有点意思啊,有持续的关注。charge variants的分离我觉得还是displacement chromatography效果最好。另外,这个图谱确实不正常,整体偏右。现在国内做抗体药的,都没有人是全部都懂的,做培养的也许只知道发酵,但是对蛋白质的性质完全不了解,做纯化的也未必深度了解蛋白质。药物分析这块呢多数是以前做小分子的,后来转做大分子,方法虽然大同小异,但是蛋白质的复杂性决定了分析的复杂。每个部分如果没有一个牛人支持,基本就搞不成。7楼这个确实很有意思,我以前确实碰到过这种蛋白,离子柱可以分得很好,但是后面每一个单独组分再分析又变了,不过这样的抗体确实没碰到过。按道理,抗体的charge variant虽然有多种成因,但是在下游纯化完成后最容易发生的也就是oxidation和deamidation了,有些可能还有Asp的isomerization啥的。如果真像7楼说的,倒是可以分析抗体里面是否含有这种金属离子导致构象出现了变化。
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