小中大一年多过去了,看到这么多战友持续关注,感到很欣慰。电荷异构体的课题也做完啦,感谢各位战友给予的帮助。
最终分离的样品
对于最初提的问题,做个总结,欢迎补充讨论。
1、分离方法:最开始分离电荷异构体时,考虑过用置换色谱(displacement chromatography),也有相应的文献参考,找到了置换剂,但置换剂过贵,且仍需检测置换剂的残留,最终放弃这个方法,改用半制备的离子交换柱,与分析型的一致,也有利于直观观察收集。 不过此方法收集量小,做常规分析够用。 若准备做细胞活性分析及动物实验,建议直接去探索置换色谱吧。 分离后,样品的保存很关键,后续的检测方法条件也值得推敲。
2、关于图谱偏右: 偏右的原因还是因为上样量亦或是分离条件受限,尝试过降低上样量,峰型对称因子变好,但由于微小的组分分辨差,导致比例差异大。 尝试过加大洗脱液离子强度,也同样能形成不拖尾的峰,但同样也易使碱性峰被洗脱,影响分析结果。 综上,受限于离子性质过近,某些翻译后修饰量甚小,选择分离条件时要平衡这些因素。个人感觉,原则上能表征CQA,同时方法耐受性、重复性等等均符合。
3、酸碱性成因: 24楼 jackieustc 提到了类克的酸碱性峰主要的形成原因,但如氧化、异构化等并未提及。 我所做的抗体 结果显示,酸性峰主要由脱酰胺、唾液酸、蛋氨酸组氨酸氧化 、异构化等,碱性峰主要有赖氨酸、氧化、多聚、man5等导致,酸碱性峰中性糖差异也显著,如G0 G1F man5,这些中性糖是否会通过构象影响与柱子的结果,现在也不得而知,已有多篇报道,并未得到一致结果。
4、酸碱性峰的转化:关于转化,主要牵扯到的是哪种翻译后修饰占主导。如唾液酸使抗体带负电,而赖氨酸会使抗体增加一个正电荷,若抗体同时存在唾液酸及赖氨酸,情况又会是如何? 两个赖氨酸存在下,会增大两个电荷,因而主要是碱性效应。 若在培养纯化等过程,赖氨酸被切除,碱性异构体就会转化成酸性异构体。7楼提到的CU离子,最终影响的也是赖氨酸的形成。 在课题中遇到酸碱性异构体中255位蛋氨酸氧化明显、经CPB处理后,碱性减少,酸性第一峰比例增加;经双氧水处理后,酸性第一峰同样增加显著。 这些现象似乎就能说明,对于此抗体255位蛋氨酸氧化导致构象改变,形成酸性异构体,但若末端赖氨酸存在,正电荷效应更加显著,最终主要显示碱性峰效应。受限于仪器条件,证明过程并为深入研究。
几点建议: 1、 关注聚体,聚体主要显示碱性,对离子分布、疏水分布及后续的活性实验都有很大影响。因为做碱性分析时,最好排除聚体干扰。
2、 疏水色谱在行业内并为得到较好的应用,但是其在表征PTM尤其是异构化,氧化等作用很显著。
3、 多读文献,由于PTM太过复杂,文献的积累很重要。当年提这个问题时啥都不懂,看了不下百篇文献后,很多问题都已经心中有底,只缺实验验证。
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楼主能把酸2和碱1峰分开,值得庆贺。我想问下,用的填料类型和柱长高度,可否告知?有没有使用特别的试剂?
另外,楼主提到糖型差异会引起碱性峰的比例增加,是将碱性峰做过糖谱分析的吗?