【讨论帖】Autophagy（自噬）

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标题:【讨论帖】Autophagy（自噬）

NBA[使用道具]
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发表于 2016-4-14 11:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

自噬是近年来很热门的领域，搜了一下园子，发现没有这方面系统的介绍或讨论，但很多战友有这方面的疑问，加上本人最近对此也非常感兴趣，因此，借本版来专门讨论一下自噬（说实在的，自噬属于丁香园哪一个版块的范围我也选不好），与各位同行或有志于研究自噬的战友共同学习，也欢迎大家提出自己的看法，本人的目的就是交流。
自噬相关文献的全文——纳米盘下载key：123
内容：
1）什么是自噬？
包括自噬的定义、形态学特征、分子基础、调控等
2）自噬的意义
自噬与细胞存活、细胞死亡、疾病、衰老等的关系
3）怎么研究自噬？
主要谈谈怎么证明细胞发生了自噬，即自噬的判断标准和各种研究自噬的方法及局限性。

[ 本帖最后由 NBA 于 2016-4-14 16:21 编辑 ]

yjf1026[使用道具]
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发表于 2016-4-14 11:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

自噬的抑制
根据自噬形成的过程，自噬的抑制也分为不同的阶段，包括自噬的起始阶段，自噬泡和溶酶体融合阶段，以及溶酶体内的降解阶段。目前常用的一些抑制药物如下：
（1）对自噬体形成的抑制：主要是PI3K通路的抑制剂（如3-MA, Wortmannin，LY294002等），这些药物均可干扰或阻断自噬体形成。3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine, 3-MA）是磷脂酰肌醇3激酶的抑制剂，可特异性阻断Autophagy中自噬体的形成，被广泛用作Autophagy的抑制剂。另外，渥曼青霉素（Wortmannin）、LY294002 也可用作Autophagy的抑制剂。
（2）对自噬体与溶酶体融合的抑制：对自噬体与溶酶体融合过程进行阻断也能起着抑制自噬的作用，这些药物有巴伐洛霉素A1、长春碱、诺考达唑等。巴伐洛霉素A1（Bafilomycin A1）是一种来源于灰色链霉菌的大环内酯类抗生素，分子式C35H58O9，是空泡型H+-ATP酶的特异性抑制剂，具有抗菌、抗真菌、抗肿瘤等作用。当突触小泡经历胞外分泌时，巴伐洛霉素A1可以避免小泡重新酸化。有研究表明，在已发生自噬的肿瘤细胞中加入巴伐洛霉素A1，可使蛋白降解被抑制，自噬体增多而自噬溶酶体数目减少，并且自噬体中的酸性磷酸酶的活性也明显降低，从而证明其阻断了自噬体与溶酶体的融合过程。这种阻断是可逆的，在去除了药物作用后，自噬体仍可以与溶酶体融合形成自噬溶酶体，继续自噬进程。
（3）对溶酶体降解的抑制: 自噬体与溶酶体融合后最终被溶酶体中的水解酶水解，它首先经过囊泡酸化，达到所需的PH值后经多种蛋白酶作用使囊内容物降解，降解产物在细胞内再循环利用。对溶酶体的降解进行抑制，使得被降解的囊泡内容物大量蓄积于溶酶体内，而不能释放出来进入细胞内再循环利用，这也同样起着抑制自噬的作用。因此，蛋白酶抑制剂，如E64d、Pepstatin A等，在抑制溶酶体降解的过程中发挥着自噬抑制剂的作用。E64d和Pepstatin A均属于蛋白酶抑制剂，二者以1：1的比例联用可以抑制自噬。有研究表明，在结肠癌细胞系中联用E64d及Pepstatin A，可明显抑制溶酶体的降解从而阻断自噬的进展，而自噬体的形成并没有受到明显影响。

mamamiya[使用道具]
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发表于 2016-4-14 11:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主介绍的还挺详细，我现在也在做细胞自噬的课题，方法简单，但是要有效果也不容易。介绍一篇检测真核细胞细胞自噬的指导性文章，Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes，Autophagy 4:2, 151-175; 16 February 2008。这是200多位细胞自噬的专家署名的文章，对检测细胞自噬绝对有用。而且这几年文章发展看来，想证明细胞自噬越来越难，需要的实验越来越多。

04906[使用道具]
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发表于 2016-4-14 11:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

自噬体的检测
自噬体的检测对研究自噬尤为重要①以透射电子显微镜下超微结构的形态学检测(俗称检测自噬体的金指标)。在透射电镜下可见损伤的细胞器如线粒体的肿胀变性，其周围出现空泡状双层膜样结构、继而双层膜环绕成自噬体、进而与溶酶体融合，消化，也可见自噬溶酶体内最终不能降解的残体等。
②自噬体膜标志性蛋白质的检测。自噬体膜上标志性蛋白质有Apgl2-Apg5结合体和微管相关蛋白1的轻链3(LC3)。Apgl2和Apg5在翻译后就像单个分子一样共价结合在一起，它定位在自噬体双层隔离膜的整个延长阶段。LC3是酵母菌自噬基因(Apg7/Apg8)在哺乳动物中的同源物，和前者相比，LC3除了定位在自噬体分隔膜上，也一直以和磷脂酰乙醇胺即脑磷脂(PE)结合的形式(LC3-PE)存在于自噬体形成各阶段的内外膜上，在自噬溶酶体膜上也可见。通过与绿色荧光蛋白(GFP)结合成Apgl2-Apg5-GFP、LC3-GFP，即可实现对自噬体的检测。
③单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法。是自噬发生过程中分析分子水平机制的一种特异的检测自噬体方法。自噬体形成依赖的第二个泛素样结合系统(Apg8)是位于自噬囊泡膜上与IVIDC特异结合的生化标志，通过荧光染色，在荧光显微镜下可见核周区域阳性显色。④间接自噬体检测法。自噬溶酶体及其不能降解的产物—残体的检测。自噬体和溶酶体融合后，除上述的LC3-GFP法检测外，还有吖啶橙染色法。它是一种荧光染料作为非极性反胶态分子团的分子探针，在自噬溶酶体内酸性磷酸酶活性增强下显著着色。对残体的检测主要是对脂褐素颗粒的显微观察。

NBA[使用道具]
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发表于 2016-4-14 11:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

自噬的过程——从一张图片开始：
步骤1：细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，但它并不呈球形，而是扁平的，就像一个由2层脂双层组成的碗，可在电镜下观察到，被称为Phagophore，是自噬发生的铁证之一。
步骤2：Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，包括细胞器，全部揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，我把它翻译为“自噬体”。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有2个特征：一是双层膜，二是内含胞浆成分，如线粒体、内质网碎片等。
步骤3：自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（加了个“可”字，意思是这种情况不是必然要发生的）。
步骤4：自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。

附件

2016-4-14 11:11

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发表于 2016-4-14 11:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最详细的介绍：Madame Curie Bioscience Database
cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=eurekah.chapter.24952')
透射电镜下自噬的照片：

附件

2016-4-14 11:12

53866002.snap.jpg (98.62 KB)

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发表于 2016-4-14 11:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

上图的英文说明：

附件

2016-4-14 11:14

35546607.snap.jpg (53.53 KB)

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发表于 2016-4-14 11:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

自噬的特性：
1）自噬是细胞消化掉自身的一部分，即self-eating，初一看似乎对细胞不利。事实上，细胞正常情况下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。这些诱发因素很多，也是研究的热门。既有来自于细胞外的（如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等），也有细胞内的（代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等）。由于这些因素的经常性存在，因此，细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。
2）自噬过程很快，被诱导后8min即可观察到自噬体（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶体（autolysosome）基本降解消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。
3）自噬的可诱导特性：表现在2个方面，第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶段。第二是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。
4）批量降解：这是与蛋白酶体降解途径的显著区别
5）“捕获”胞浆成分的非特异性：由于自噬的速度要快、量要大，因此特异性不是首先考虑的，这与自噬的应急特性是相适应的。
6）自噬的保守性：由于自噬有利于细胞的存活，因此无论是物种间、还是各细胞类型之间（包括肿瘤细胞），自噬都普遍被保留下来（谁不喜欢留一手呢？）。
参考综述：
Autophagy fights disease through cellular self-digestion.pdf
cuturl('http://www.namipan.com/d/4c78fe31cb24080cd7630639c121cd71b24c9b56fbdf6300')

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小中大

自噬相关基因（autophagy associated gene, ATG）：在自噬过程中到底有哪些蛋白的参与，即自噬相关蛋白的鉴定是目前自噬研究主要的任务。由于自噬研究的历史关系，很多基因在酵母和哺乳动物中有不同的命名。
在cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=eurekah.table.24964') 中介绍了一些较早发现的自噬相关基因，下面列出几个新近发现的：
1）bif-1（又叫Endophilin B1）和 UVRAG（ultraviolet irradiation resistance-associated gene）
相关文章：Bif-1 interacts with Beclin 1 through UVRAG and regulates autophagy and tumorigenesis.pdf
cuturl('http://www.namipan.com/d/75c245aa6c8cf8644c33bcf86e8c6ef8add3da69469e0e00')
2）VMP1 （Vacuole membrane protein 1）
相关文章：The Pancreatitis-induced Vacuole Membrane Protein 1 Triggers Autophagy in Mammalian Cells.pdf
cuturl('http://www.namipan.com/d/a4a74e47a1d515089558fe39db2177ff931ee8114a611e00')
3）DRAM （damage-regulated autophagy modulator）
相关文章：DRAM, a p53-Induced Modulator of Autophagy, Is Critical for Apoptosis.pdf
cuturl('http://www.namipan.com/d/69fee934467a3fc4b9a70b88c9292160a631c78f42111300')
4）TP53INP2 （Tumour Protein 53 Induced Nuclear Protein 2）
相关文章：The TP53INP2 Protein Is Required for Autophagy in Mammalian Cells.pdf
cuturl('http://www.namipan.com/d/40e5d3a2f6a0ec5fce4dc91c32880ae293201a582cf33500')
（由于不断有新的ATG蛋白被鉴定出来，本帖将不定期更新）

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小中大

自噬过程的调控：
从上面总结的自噬特点中可以看出，自噬这一过程一旦启动，必须在度过危机后适时停止，否则，其非特异性捕获胞浆成分的特性将导致细胞发生不可逆的损伤。这也提醒我们在研究自噬时一定要动态观察，任何横断面的研究结果都不足以评价自噬的活性。
目前，已经报告了很多因素能诱导细胞发生自噬，如饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等等，这么多刺激信号如何传递的、哪些自噬蛋白接受信号、又有哪些自噬蛋白去执行等很多问题都还在等待进一步解答中。
关于传递自噬信号的通路目前比较肯定的有：
抑制类
1）Class I PI3K pathway （PI——phosphatidylinositol，磷脂酰肌醇）
与IRS (Insulin receptor substrate) 结合，接受胰岛素受体传来的信号（血糖水平高抑制自噬）
详细介绍参见：
维基百科 cuturl('http://en.wikipedia.org/wiki/Phosphoinositide_3-kinase')
cuturl('http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-biology/learning-center/pathfinder/pathway-maps/pi3k-signaling.html')
2）mTOR pathway（mammalian target of rapamycin）
mTOR在人类中的同源基因是FRAP1（FK506 binding protein 12-rapamycin associated protein 1），是一个丝/苏氨酸蛋白激酶。能接受多种上游信号，如Class I PI3K、IGF-1/2、MAPK，能感受营养和能量的变化。
详细介绍见：
cuturl('http://en.wikipedia.org/wiki/MTOR')
激活类
1）Class III PI3K
结构上类似于Class I PI3K，但作用相反。
接受上述信号的自噬蛋白：
目前都把焦点集中在beclin 1（酵母同源物为atg6），能与多种蛋白结合，如Vps34（Class III PI3K的催化亚单位），mTOR，BCL-2和BCLXL蛋白等，更多介绍请参阅OMIM：cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=604378') 。
在【动态版】cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=154&id=14115812&sty=1') 中介绍了日本科学家最新的发现：beclin-1有可能成为人工干预自噬活性的靶点。
需注意的是，beclin-1是一个多功能蛋白，除了接受自噬信号，它还可以接受很多其它的信号对自噬进行调节，越来越多的证据表明，beclin-1可能是自噬的“守门人”。
自噬体的发生：
目前认为，自噬体的膜不是直接来源于高尔基体或内质网，而是在胞浆中重新生成的，但具体的机制尚不清楚。
当beclin-1被活化后，胞浆中先形成很多个membrane source（自噬体膜发生中心），在它们不断扩展的过程中（phagophore到autolysosome），VMP1蛋白由内质网和高尔基体转位到自噬体膜上（VMP1又叫TMEM49，已知唯一与自噬有关的跨膜蛋白），同时，MAP1-LC3由胞浆型（即LC3-I）转位到自噬体膜（即LC3-II），LC3这一转变过程可被Western Blot和荧光显微镜检测到，现已成为监测自噬体形成的推荐方法。
（更新中。。。）

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