【转帖】Transwell侵袭实验总结

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标题:【转帖】Transwell侵袭实验总结

ukonptp[使用道具]
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发表于 2016-4-15 14:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

整理此帖，在整理的过程中也学到很多知识，在此与大家分享。

wu11998866[使用道具]
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发表于 2016-4-15 14:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做迁移试验，结晶紫染色。染色后我在显微镜下可以看到成片的细胞但是就是没被染色
做了两次都出现这种情况，请大家帮忙分析一下吧

831226[使用道具]
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发表于 2016-4-15 14:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是否染色时间太短？或者你根本没有看到细胞，而是膜上的那些小孔？我是这样染的，你可以参考：
结晶紫用甲醇配成0.5%的母液，使用浓度为0.1％，用PBS按1：4稀释后即为染色液。
染色方法:用PBS缓冲液洗细胞1-2次,吸尽残余的液体，加入甲醇固定20分钟,弃固定液,加入结晶紫染液,染色10-20分钟,弃染色液,用PBS冲洗干净即可！

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发表于 2016-4-15 14:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

自制小室的心得：小室是重复利用的，膜是自己买的（whatman?)一百张580元，每张可以剪出4个24孔板用的膜，也就是说一块板要6张，可以做16次，先用将小室的圆大小绕小室画在纸上，剪一个膜板出来，然后再用模版剪就可以避免浪费了，以前师兄都只能剪3个，改进后就成4个了，可以省4次。然后就是把膜贴在小室上，个人建议用乙醇清洗小室，不用水，干得快。用指甲油贴上膜就好了（涂在小室口径上，不要太多，够封好就行，太多会流到膜上影响细胞闯过）。最后紫外过夜就行了。
个人觉得做小室还是挺有意思的，也有艺术感和成就感产生，是实验中休息放松的好方式。

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发表于 2016-4-15 14:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

细胞要染色后才比较好看的，一般用结晶紫，上层的细胞可以用棉签把它擦掉。
个人感觉做几种肿瘤细胞的迁移能力的比较时，接种的细胞量和实验时间非常重要，如果细胞数太多或是培养时间太长，都会使本来有迁移能力差别的细胞之间的差别不显著甚至是没有。这个首先可以参考别人文献的细胞用量及时间，再结合自己的要求进行实验，所以刚开始时不要做太多的处理组，而要把条件摸好再说。
show几张我做的迁移实验：

附件

2016-4-15 14:33

59795647.snap.jpg (23.24 KB)

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发表于 2016-4-15 14:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

第一节概念
这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。
1．Transwell
关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。
更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。
Fig1

附件

2016-4-15 14:35

27887694.jpg (14.05 KB)

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发表于 2016-4-15 14:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
下图是一个Transwell装置的纵切面
Fig2

附件

2016-4-15 14:36

54451780.jpg (8.07 KB)

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发表于 2016-4-15 14:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
Fig3

附件

2016-4-15 14:40

83599385.jpg (6.5 KB)

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发表于 2016-4-15 14:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验：
(1).共培养体系：
小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。常用0.4、3.0µm。我们实验室用的是0.4µm。
Fig4

附件

2016-4-15 14:41

37266871.jpg (7.47 KB)

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发表于 2016-4-15 14:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。
(2).趋化性实验
可用5.0、8.0、12.0µm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。
①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。
②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。
(3).肿瘤细胞迁移实验
常用8.0、12.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
(4).肿瘤细胞侵袭实验
常用8.0、12.0µm膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似。
Fig5

附件

2016-4-15 14:42

27384543.jpg (6.45 KB)

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