小中大【求助】PTD介导的蛋白质转导技术及其在神经系统
疾病治疗中的应用
生理状态下，真核生物细胞膜仅对少量小分子具有通透性，大大限制了生物大分子药物对疾病的治疗。由于转基因技术可操作性差、转运效率低、具有潜在的生物毒性作用、并且并非所有细胞均能被转染等缺点，限制了其实际应用[1]。PTD介导的蛋白质转导技术则使大分子蛋白质或多肽自由通透细胞膜成为可能，随之产生疾病蛋白质治疗技术。本文就这一技术及其在神经系统疾病治疗中的意义作一综述。
1.蛋白质转导域(protein transduction domain，PTD)：
又称为细胞穿膜多肽(cell-penetrating peptides, CPP)，是一类能够介导与之相连的多肽或者全长蛋白质穿过生物膜进入细胞的多肽结构，最初是发现于HIV病毒转录因子Tat蛋白中。目前已发现多种含有PTD的蛋白质，主要有以下几种：
1)HIV病毒Tat蛋白：是病毒复制后期所必需的转录调控因子，全长86个氨基酸。Mann 和Schwarze等确定具有蛋白转导功能的最小肽段是47-57氨基酸(YGRKKRRQRRR) [2]。
2)单纯疱疹病毒(HSV)VP22蛋白：是成熟病毒蛋白衣壳与包膜之间的间层蛋白的主要成分，全长301氨基酸。目前认为具有蛋白转运功能的是C端34个氨基酸(DAATATRGRS AASRPTERPRAPARSASRPRRPVE)，但目前通常仍以VP22全长cDNA与外源基因连接后以病毒载体等方式转染靶细胞[3]。
3)果蝇触角蛋白同源结构域(AntpHD)：果蝇体内存在一族称为“同源蛋白(homeoproteins)”的转录因子，AntpHD是其中典型的一种，包括三个强碱性的螺旋结构，对蛋白质起转导作用的是由16个氨基酸组成的第三个螺旋结构(RQIKIWFQNRR MKWKK)[4]。
4)人工设计的PTD：Mitchell等合成9个L-精氨酸(R9)或9个D-精氨酸(r9)组成的多肽，分别比Tat-PTD的蛋白转导效率高20倍或100倍[5]；May等设计并合成21个氨基酸的多肽(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV)，与30kD的GFP, 110kDβ-Gal及全长特异性抗体交连后表现出很高效率的蛋白转导作用并保持生物活性[6]；
5)其他PTD蛋白：流感病毒血凝素及乳铁转运蛋白，成纤维细胞生长因子1、2及最近发现的谷胱苷肽转移酶(GST)[7]等均具有相似的功能，但研究较少。
2.PTD转导蛋白的特点
1)转导效率高：PTD可以将与之相连的多肽或全长蛋白质在数分钟内转导进入细胞，目前已将>100kD的蛋白质如β半乳糖苷酶转导进入小鼠体内并保持了生物活性[8]。
2)能量、受体非依赖性：Vives、Derossi等研究发现，用代谢酶抑制剂叠氮钠，鱼藤酮或冈田酸等阻断细胞能量代谢后，并不影响Tat或AntpHD介导的蛋白质转导作用；在4℃下仍然可以进行且转导效率没有显得降低；应用细胞内吞抑制剂对Tat蛋白质转导也没有明显影响[9,10]。Futaki等用D-氨基酸全部替换Tat-PTD后转导效率不改变，说明蛋白质转导也不是受体介导的[11]。
3)可以通透血脑屏障(blood brain barrier, BBB)：与PTD融合表达的蛋白不仅可以穿膜进入体外培养的细胞，而且可以通过血液循环运输至脑组织，跨越血脑屏障进入神经元或胶质细胞内，为大分子蛋白治疗中枢神经系统疾病提供了可能[8]。
4)应用广泛： PTD不仅可以介导多肽或者全长蛋白质进入细胞，而且可以介导各种巨型分子如寡核苷酸链[12]，直径大于50nm的磁珠[13],连接放射性物质的树脂分子[14],甚至是200nm的脂质体[15]等，均可被PTD转导进入细胞。
3.PTD介导蛋白转导的机制
1) PTDs的氨基酸组成分析:生理状态下，碱性氨基酸有精氨酸(Arginine,R)和赖氨酸(Lysine，K)，带正电荷；酸性氨基酸有天冬氨酸(Aspartate,D)和谷氨酸(Glutamate,E)，带有负电荷。在真核生物编码的蛋白质中，碱性、酸性氨基酸出现的几率是分别是0.1和0.11；分析PTDs的氨基酸序列发现，K和R出现的几率比预期几率高3-7倍,D和E则几乎不出现。PTDs等电点(PI)均>9，生理状态下带有正电荷[16]。
表1 转导区的氨基酸组成分析(Leifert et al, 2003)
Sequence Basic Acidic PI
