[求助]氨基酸标准曲线制作

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标题:[求助]氨基酸标准曲线制作

zsxan1990[使用道具]
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发表于 2011-11-3 11:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

[求助]氨基酸标准曲线制作

我用茚三酮法做谷氨酸的标准曲线，做了7次还没做出来，原来怀疑药品有问题，以为时间长了出现结晶。但买了新的茚三酮还是做不出来。测得OD值要么很小：0。003。还有就是第4个浓度会比第5，6个的都大，不知道是这么回事。我这是照国家标准方法做的。请有做过这类标准曲线的大侠帮忙。在这里谢谢了！

koook5695[使用道具]
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发表于 2011-11-3 11:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

把国家标准含量测定那段可以附上来大家看看

然后把你的具体试验方法写出来，大家一起来分析分析

2541[使用道具]
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发表于 2011-11-3 11:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

尽量缩短标准曲线的跨度范围，太大的浓度跨越是不合适的，尤其上蛋白质类的，前天我做酶的标准曲线，用ＨＰＬＣ/ＵＶ做的，大范围浓度基本上做出来后，回归系数极差，才２个９，浓度跨越是１００倍，后来我缩小到１０倍，回归系数基本上接近一，截距也很小．
还有显色的时间要控制好，就是上面我说的酶，在做含量的时候，我们是使用秒表计时的，１分钟做一个样品，然后到时间后１分钟测一个，保证反应时间一致．
我不只你的ＧＢ是什么样的，不过空白应该都是要做的．
还有ＵＶ机，要进行定期校验！
最后可以做个全波长扫描，看看是不是在指定波长有较大的吸收．

外行建议，仅供参考．

04906[使用道具]
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发表于 2011-11-3 11:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

斑竹有理啊，很多人都是提个摸棱两可的问题，就是问题，没有背景，没有自己对该问题的看法，甚至自己解决问题后也不来改个标题．
我觉得对他们，我们太累．

zsxan1990[使用道具]
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发表于 2011-11-3 11:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

真是对比起这些天也是实验室不能上网，首先谢谢大家的关心。现在我把国家标准的步骤写下来，我们共同来研究一下。
分别吸取0.0,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0ml氨基酸工作液于一组25ml容量瓶中，各加水4ml，ph8.0磷酸缓冲液0.5ml和2%茚三酮溶液0.5ml,在沸水加热15min,冷却后加水定容至25ml,放置10min后,用5mm比色杯在570nm处测定吸光度.将测得的吸光度与相应的谷基酸浓度绘制标准曲线.
谷氨酸标准液:称取100mg的谷氨酸(纯度不低于99%)溶于100ml水中,作为母液.准确吸取5ml母液,加水定容至50ml作为工作液(1ml含谷氨酸0.1mg)
再有我想请问5mm的比色皿与10mm比色皿测得OD值有什么关系?是2倍的吗?
在此谢谢各位了

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发表于 2011-11-3 11:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看了方法的描述，找不出什么漏洞，也就是说理论上是成立的。
那么，实验失败应该是操作或试剂引起的，我认为最有可能出错的地方有两个：
1. 移取液体时是否是用移液管移的或者是用移液枪移的，特别要提醒的是移液枪会因吸头的影响而导致加样量不准。
2. 沸水加热时是否会蒸干，因为里面溶液量并不多，15分钟可能会蒸发大量水分，使部分茚三酮和氨基酸析出并附在容量瓶壁上而未参加反应。我认为加热时应该把盖子盖上，虽然会被蒸汽冲开，但应马上盖回去，并在加热过程中最好偶尔摇动，使反应均匀。不知楼主是否也这样做的。

另外，针对楼主提出的问题，本人以为最好是请一位药物分析技能较高的同志到现场进行指导，这样更容易帮助发现问题。也希望斑竹组织各地的战友一起组建一个专家组，为当地的求助者进行现场服务，当然可以适当收取车旅费。

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发表于 2011-11-3 11:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

OD是optical delnsity（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里出现的专有名词 :光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。

那么10mm比色皿测得OD值就应该是5mm比色皿测得OD值的2倍.

04906[使用道具]
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发表于 2011-11-3 11:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

真是对比起这些天也是实验室不能上网，首先谢谢大家的关心。现在我把国家标准的步骤写下来，我们共同来研究一下。
分别吸取0.0,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0ml氨基酸工作液于一组25ml容量瓶中，各加水4ml,加水至4ml比较好
，ph8.0磷酸缓冲液0.5ml和2%茚三酮溶液0.5ml,在沸水加热15min,，冷却改为迅速冷却
后加水定容至25ml,放置10min后,用5mm比色杯在570nm处测定吸光度.将测得的吸光度与相应的谷基酸浓度绘制标准曲线.
谷氨酸标准液:称取100mg的谷氨酸(纯度不低于99%)溶于100ml水中,作为母液.准确吸取5ml母液,加水定容至50ml作为工作液(1ml含谷氨酸0.1mg)
再有我想请问5mm的比色皿与10mm比色皿测得OD值有什么关系?是2倍的吗?
在此谢谢各位了

试液配制部分请再核查:
pH8.0磷酸盐缓冲液:
按GB 8313—87《茶茶多酚测定》中3.2的规定,配制1/15M磷酸氢二钠(3.2.1)和
1/15M磷酸二氢钾(3.2.2)溶液。然后取1/15M的磷酸氢二钠溶液95mL和1/15M磷酸二氢
钾溶液5mL,混匀。
3.2 2％茚三酮溶液: 称取水合茚三酮(纯度不低于99％)2g,加50mL水和80mg氯化亚锡
(GB638—78,分析纯),搅拌均匀。分次加少量水溶解,放在暗处,静置一昼夜,过滤后加水
定容至100mL。茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入0.25g 活性炭，轻轻搅拌。加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。

注: 制作标准曲线时,所用蒸馏水,必须是二次蒸馏水。

zsxan1990[使用道具]
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发表于 2011-11-3 11:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我就是在做茶叶的游离氨基酸的量就是参照楼主所说的方法配置的溶液．我也测了缓冲液的ph确实是8.0多些，我吸液体时是用的移液枪，不过每次都比较小心。沸水浴时也是家盖的。看了数据还以为做出的曲线可能是抛物线形式的，结果查了文献是直线，我现在做这个标曲都有些发愁了，也懒得再做。觉得失败啊！谢谢大家的帮忙！！

zsxan1990[使用道具]
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发表于 2011-11-3 11:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问楼主你做的时候也是用的我所描述的方法吗?我前两天又做了3次还是不成功,我估计至少做了10多次了.不成功只好换方法了.

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