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标题:浅谈蛋白磷酸化位点鉴定

longcz[使用道具]
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发表于 2007-11-8 18:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

浅谈蛋白磷酸化位点鉴定

小弟做过两年蛋白磷酸化位点鉴定，现在在家里上网，手边没有文献，边想边写，谈谈点个人看法：

1.蛋白的可逆磷酸化在生命过程中，特别是信号转导过程中那是相当重要，地球人都知道，我就不多说了：
1992年诺贝尔生理或医学奖授予给了Edmond Fischer 和 Edwin Krebs
"for their discoveries concerning reversible protein phosphorylation as a biological regulatory mechanism"


[ 本帖最后由 longcz 于 2007-11-8 19:38 编辑 ]
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发表于 2007-11-8 18:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Edmond H. Fischer 和Edwin G. Krebs



[ 本帖最后由 longcz 于 2007-11-8 19:03 编辑 ]
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发表于 2007-11-8 18:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
2. 历史
在很久很久以前，呵呵，也就是在质谱技术用来鉴定蛋白磷酸化位点前，想知道一个蛋白的磷酸化位点是很痛苦的，大多用P32或者点突变的方法，不仅费时费力，灵敏度还不高，巨痛苦无比。生物科学家们做梦都想怎么能又快又好的鉴定磷酸化位点呢？

3. 平地一声春雷响，生物质谱技术诞生了！
简单的讲，磷酸化会导致+80Da的分子量差异，通过测定这个差异，就可找到具体的位点了


[ 本帖最后由 longcz 于 2007-11-8 19:04 编辑 ]
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发表于 2007-11-8 18:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请上传图片后，把光标停在要插入图片的位置，

然后，点击“插入”。

请见“在帖子中如何上传图片”

[ 本帖最后由 snow_white 于 2007-11-8 18:49 编辑 ]
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发表于 2007-11-8 18:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

4. 挑战

由于看到了下面的问题
http://bbs.antpedia.com/viewthread.php?tid=452&extra=page%3D1
于是先谈谈一下用质谱鉴定蛋白磷酸化位点的难点和解决方案
1) 磷酸化蛋白的化学计量值很低。生理条件下，蛋白一般不会100%的磷酸化，所以，只有部分的位点被部分磷酸化，于是蛋白酶解后得到磷酸化的多肽就不会太多，
由于带负电，常用的胰蛋白酶常酶切效率不高（因为它酶切位点是带正电的Lys和Arg）
要命的是磷酸化的多肽在离子源的离子化效率也不高（可能和带负电有关）。更要命的是，非磷酸化的多肽还会抑制磷酸化多肽的信号，这样几步下来，得到的磷酸化就更少了

解决方案：
A. 在负离子模式下检测磷酸化的多肽
B. MALDI-TOF中可以在matrix里加入磷酸，帮助磷酸化的多肽的离子化
C. 预先分离和富集磷酸化的多肽

在实际工作中，预先分离和富集磷酸化的多肽用得比较多

[ 本帖最后由 longcz 于 2007-11-8 19:43 编辑 ]
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发表于 2007-11-8 19:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

4.预先分离和富集磷酸化的多肽的具体方法

谢谢snow_white，现在图片显示正常了

预先分离和富集磷酸化的多肽的具体方法
1).利用磷酸基团带负电分离
  A）常见的有IMAC技术:immobilized metal affinity chromatography.IMAC是前几年选择性分离和富集磷酸化肽最广泛的方法。键合在螯合底物上的带正点的金属离子（Fe或Ga,Zn等）选择性地与磷酸化肽中的磷酸通过电荷作用部分相结合，并且在高pH 或磷酸缓冲液中磷酸化肽可以释放出来。
优点：每一个可溶磷酸化肽，不管其长度如何都能被富集，而且IMAC柱洗脱下的样品可直接用于RP—HPLC分析可以高通量的分析。
缺陷：非特异性结合较多，比如含有较多酸性氨基酸D和E的也可能被富集
          不能与IMAC相结合的磷酸化肽和难于洗脱的磷酸化肽可能会丢失。
B) TiO2富集，这个方法是最近常用的新方法，可能成为主流，后面再重点讲讲~
C) 离子交换色谱，简单的讲，单磷酸化的多肽会比普通多肽少带一个正点（被磷酸基团屏蔽了），收集阳离子交换色谱中的穿透峰可以部分富集磷酸化的多肽

[ 本帖最后由 longcz 于 2007-11-8 20:00 编辑 ]
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发表于 2007-11-13 09:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
多谢楼主，开篇就介绍了为什么要做，做的难度，现有的技术手段。使我们尚未知其然先知其所以然，希望多多介绍各种富集方法、对比。如何实现？实验步骤和技巧能写上就更好了。
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 小中大
:) :) :) :) :) :) :) :) :) :) :)
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 小中大
看看~~~~
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