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标题:[讨论帖]质测定中加校正因子的主成分自身对照法

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[讨论帖]质测定中加校正因子的主成分自身对照法

[讨论帖]质测定中加校正因子的主成分自身对照法的校正因子测定问题




大家来讨论一下吧:篇幅很长,我就不以附件的形式发上来了,只希望大家好好发表一下意见,提出你们已经积累的经验,指导一下后辈,万分感激了,当然,觉得本贴好的话,给我加分和投票吧?谢谢!!

杂质测定中加校正因子的主成分自身对照法:
在杂质研究中,因某一杂质与主成分在某一波长下的响应因子不在0.9-1.1范围内,可考虑采用加校正因子的主成分自身对照法。此校正因子可直接载入各品种项下,用于校正杂质的实测峰面积。这些需做校正因子的杂质,通常以主成分为参照,采用相对保留时间定位,其数值一并载入各品种项下。(可以理解为校正因子具有法律效应的作用)
关于校正因子的理论知识如下:
色谱定量分析的依据是被测组分量与检测器的响应信号(峰面积或峰高)成正比。但是同一种物质在不同类型检测器上往往有不同的响应灵敏度;同样,不同物质在同一检测器上的响应灵敏度也往往不同,即相同量的不同物质产生不同值的峰面积或峰高。这样,各组分峰面积或峰高的相对百分数并不等于样品中各组分的百分含量。
色谱的检测器对不同物质有不同的响应,换句话说,1mg化合物A在检测器上能产生1000mAu的响应,但同样是1mg的化合物B在该检测器上也许就只能产生847mAu的响应,所以我们不能在检测器输出1000mAu的响应时就认定样品中一定含有1mg化合物,这时就必须引入定量校正因子。校正后的峰面积或峰高可以定量地代表物质的量,校正因子的作用就是反映某物质的量与检测器响应之间的关系。
定量校正因子分为两种:
1、绝对定量校正因子f;f=M/A,(其中M代表被测物质的量,A代表检测器信号响应,可以是峰面积或峰高),其意义为单位响应所反映的物质量。绝对定量校正因子,即单位峰面积所代表的物质量。这是以峰面积表示的定量校正因子,也可以用峰高来表示定量校正因子。此外,也有用它们的倒数来表示的,简称为响应值。绝对定量校正因子的值随色谱实验条件而改变,因而很少使用。
2、相对定量校正因子f';f'=fi/fs=(Mi/Ai)/(Ms/As)=(Mi*As)/(Ms*Ai),(其中i代表被测定物质,s代表选定的基准物质)。定义为某物质i与所选定的基准物质s的绝对定量校正因子(即单位峰面积所代表的物质的量)之比。
绝对定量校正因子一般用于外标法,相对定量校正因子一般用于内标法。
色谱法的含量测定中之所以要先用待测成分的对照品来建立校准曲线,然后才用这个曲线来计算待测样品中该化合物的含量,实际上就是在测定样品前先确定校正因子。日常操作中我们都是以:M标/A标=M样/A样 直接计算样品含量了,所以没太注意有什么校正因子,事实上只要将公式作一个简单的变形:M样=A样*(M标/A标),不难看出式中的(M标/A标)其实正是定量校正因子f,那么M样=A样*f了。(简单来说可以理解为标准曲线的斜率)
所以,用面积归一化比法做含量测定时,不可简单地认为各成分的峰面积百分比就是它们的含量百分比哦,理由如上所述,各成分含量与响应的比例关系可不一定都相同啊!
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理论知识已经放在前面了,那就来实际操作的,在杂质分析的测定中,加校正因子的主成分自身对照法,那校正因子究竟怎么测定呢?
有几个问题需要明确的:
1、测定校正因子时,如何取主成分的浓度,如何取杂质的浓度?药典上说:精密称取杂质对照品和待测成分对照品各适量,配制测定杂质校正因子的溶液,进样测定计算。那“适量”是如何确定的呢?范围是多少?
2、主成分取几个浓度,杂质取几个浓度?要做线性吗?校正因子的测定浓度应该要在线性范围内?否则无法定量,而不同浓度进样的校正因子误差要符合什么要求?
3、需要求多少的F值(F值究竟是多大)才能够符合做标准的规定。因为是加校正因子的主成分的自身对照法,F值必须是在一定范围内是一个定数,才能写到标准里面去吧?
4、响应因子与校正因子是成倒数关系,计算响应因子是否需要做RSD,那计算响应因子的主成分和杂质的浓度是选择多少为合适?
5、测定相对校正因子是否需要做方法学验证?验证的内容有哪些?(线性范围?重复性?还有么?需要做线性吗?相似浓度下或线性范围内的校正因子的重复性是不是应该在2%以内?)
6、若已知杂质(合成的中间体,自己可以合成,但买不到对照品,只能做结构确认)无标准品,只用面积归一化法测定该物质的百分含量,再测水分、干燥失重、残渣作为必要的补充和扣除就可以了么?测定时首先准确称量主成分和已知杂质,然后将它们混合均匀进样,分别测出其峰面积,再进行计算。这样就可以了么?
7、测定校正因子后,操作方法可如下:
取供试品溶液和自身对照溶液,分别进样,测量供试品溶液色谱图上杂质的峰面积,分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较,依法计算各杂质含量。
原理:C杂质=f*A杂质/(A供试品/C供试品)
杂质%=C杂质/C供试品*100%
因供试品溶液浓度大,误差大,采用自身对照法。
若为1%自身对照,则C杂质=f*A杂质/(A自对照/(C供试品/100))=f*A杂质*C供试品/A自/100
杂质%=f*A杂质*C供试品/A自/100/C供试品*100%=f*A杂质/A自*1%
若为2%自身对照,可以把上面的C供试品/100换为C供试品/50
杂质%=f*A杂质/A自*2%。
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查了很多的文献一直没有确切的测定杂质校正因子的方法,只凭药典后面那个公式是无济于事的,要确定校正因子我感觉需要有几个问题需要解决:
1、如何求f值,如何做方法学试验
2、如何保证在规定的限度内f值的一致性
3、如何保证f值的耐用性
4、如何保证f值的重现性
5、f值是一个范围还是一个定值,如果是个定值如何确定,有效数字有什么要求。
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hulu呼噜[使用道具]
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看看我这么说对你是否有点帮助:

对于杂质测定,校正因子法无疑有其积极、低碳、绿色的地方。方法也有很多种。我这里就以【相对响应因子法】为例,来表述众多测定相对响应因子方法中的一种,希望有点参考意义。

1、假如主成份为AAA,经过研究之后发现某杂质B需要定量测定。(至于为什么需要定量测定,这个另说,可以送毕业N个烟酒生了。)

2、但是,该杂质B的获取途径相当困难,或者巴拉巴拉。。。。。。总之,就是不能确保提供对照品云云。

3、决定通过相对响应因子法测定它的量、相对保留时间来定位/定性。

4、那么,我们就穷尽一切方法,先得到有限的B,鉴定、评估纯度等等,按照一个【对照品qualify】应该的过程履行程序、、、、、

5、然后,在未来企图设定的【有关物质】测定方法的框架下,配制与之AAA和B的溶液。例如,有关物质测定方法描述为:七七八八的稀释、配制之后,得到AAA浓度大约为[A]%的溶液,作为供试液。那么,我们就配制大约为[A]%的1%~0.02%范围的AAA以及B的一系列溶液。
  考察诸如:线性、重复性、精密度、准确度等。毕竟,我们这个杂质最终的目标是要定量的,所以,要求确认的东西就多点了。

6、考察完毕后,自然得到了AAA和B在该情况下的浓度-面积之类的方程。

7、至于相对保留时间,咱就不多说了。
  但是,对于相对响应因子,其实,用6得到的两个方程的斜率来除一下就可以了。

说明一下:
方法确定相对响应因子的方法当然有很多种,上面我提及的只是其中一种。
见到国使用该方法顺利得到FDA关于N多品种(API、DP)新药的上市批准。
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有几个问题还是需要搞明白的:
“但是,对于相对响应因子,其实,用6得到的两个方程的斜率来除一下就可以了。”这个应该指的是理想情况,两个方程中不但有斜率,还有截距,需要考虑到截距的影响。可以说,只有截距在允许的误差范围内,这个才适用。
杂质测定的浓度一般要求比较低的,在低浓度下线性方程的截距一般都是比较大的,这样A杂/A主并不是简单的K杂/K主的关系。
即便是在当前的系统条件下得到了一个f值,能保证在流动相配比、色谱柱批号的变化、仪器的变化时得到相同的f吗
对f值应该是有一定的要求的,不知道国外是怎么个要求的,方法学验证需要什么内容
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回复 #5 redbutterfly 的帖子

对于截距的判断,
自然而然的在俩方程出来的时候进行判定了。截距除以该“直线”的最小浓度点的商,就是一个尺子之一。这事一个方程合理的基本要求。
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回复 #6 2541 的帖子

这还是不能解决截距如果影响很大校正因子的计算
截距不合理是客观存在的,而且这样的品种很多
举个例子,中国药典2010年版二部氨甲环酸有关物质检查,其中各杂质就规定了校正因子,但如果做氨甲环酸的自身对照的线性关系试验,得出的线性方程为:A= 228.53C + 2649.1,r=0.9992,最小浓度为30ug/ml,截距对面积的影响是27%。或者即使是按照审评中心黄晓龙老师的“有关物质分析方法验证的可接受标准简介”中要求截距应在100%响应值的25%以内,这个差别也是相当大的。所以直接以斜率比值来求校正因子是不科学的
个人认为杂质限度检查是一个限度检查,不是含量测定,所以f值要兼顾在我们所要求的浓度范围内保证杂质量的合理性,f值应该是一个综合了各方面因素有取舍而获得数值
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小野花[使用道具]
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个人认为杂质限度检查是一个限度检查,不是含量测定。说是这么说的,不过有关物质方法学验证可是不单做专属性和检测限的。如果截距过大,可能有别的干扰,或者你的标准曲线最低点就要舍去了。F值跟色谱条件是捆在一起的,色谱柱的变化影响可能不太大,不过流动相的改变很可能造成大变化。尤其是一个有离子对另一个没有的时候,此时,就需要重新考察相对因子了。
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有一个比较简便的方法:
假设杂质的限度是0.5%,那就把主成分和杂质的浓度配成0.5%的浓度(同一溶液),连续进样6针,计算平均峰面积,峰面积相除就可以了。如杂质限度是0.5%,供试品浓度是0.2mg/ml,那就把主成分和杂质的浓度均配成1ug/ml,连续进样6针,计算峰面积,计算即得。
同时,采用校正因子的主成分自身对照法,要采用相对保留时间,必须要把柱子型号、牌子、粒度等参数写到标准里去,可以省去方法学验证了。
同时,用作测定校正因子的杂质,纯度系数必须为一个明确的值,如93%,97%都可以,即用面积归一化法测定该物质的百分含量,再测水分、干燥失重、残渣作为必要的补充和扣除,当然如果有容量法测定含量,两者比较,不要差异太大即可。
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一个问题一个问题的回答
测定校正因子时,如何取主成分的浓度,如何取杂质的浓度?药典上说:精密称取杂质对照品和待测成分对照品各适量,配制测定杂质校正因子的溶液,进样测定计算。那“适量”是如何确定的呢?范围是多少?
答:杂质及主成分的浓度的确定:供试品溶液的浓度*限度%。
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