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标题:[讨论帖]HPLC的使用及维护

木槿[使用道具]
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[讨论帖]HPLC的使用及维护

[讨论帖]HPLC的使用及维护


高效液相色谱仪(HPLC) 是分析实验室常用的测试仪器之一,也是我们新药开发过程中很重要的一个技术手段,其应用越来越广泛。此种仪器在使用过程中,难免会出现各种各样的问题,并将直接影响到所测数据的准确性和仪器的正常工作。操作者如果能了解故障的成因,即可清楚预防和排除这些故障的方法,就可正确地使用仪器并最大限度地发挥仪器的性能。因此,希望开辟这样一个讨论区,有经验的朋友可以来此介绍一下在HPLC使用过程中的一些心得,大家也可以收集一些关于HPLC使用过程中需注意问题的资料来此发表,目的只有一个:就是希望更多的朋友能从中有所收获,真正的使用好HPLC这个工具。欢迎大家讨论!
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xingyi08[使用道具]
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HPLC为广大药学工作者日常工作中必不可少的仪器之一,由于其精度较高,对实验人员和实验室条件要求较高,因此保养也很重要,应引起注意:

液相色谱仪(hplc)的保养


1.HPLC的日常操作条件: 温度:10—30℃; 相对湿度<80%; 最好是恒温、恒湿,远离高电干扰、高振动设备。
2.泵的保养:
1)使用流动相尽量要清洁;
2)进液处的沙芯过滤头要经常清洗;
3)流动相交换时要防止沉淀;
4)避免泵内堵塞或有气泡;
3.进样器的保养:
1)每次分析结束后,要反复冲洗进样口,防止样品的交叉污染;
4.柱的保养:
1)柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动;
2)当柱子和色谱仪联结时, 阀件或管路一定要清洗干净;
3)要注意流动相的脱气;
4)避免使用高粘度的溶剂作为流动相;
5)进样样品要提纯;
6)严格控制进样量;
7)每天分析工作结束后,要清洗进样阀中残留的样品;
8)每天分析测定结束后,都要用适当的溶剂来清洗柱;
9)若分析柱长期不使用,应用适当有机溶剂保存并封闭;

5.检测器(UV)的保养:
1)紫外灯的保养:在分析前、柱平衡得差不多时,打开检测器;在分析完成后,马上关闭检测器。
2)样品池要保养。
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xingyi08[使用道具]
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HPLC六通阀进样器的使用及保养


六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器,它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用,各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。

工作原理:
1、手柄位进样(Load)位置时,样品经微量进样针从进样孔注射进定量环,定量环充满后,多余样品从放空孔排出;
2、将手柄转动至进样(Inject)位置时,阀与液相流路接通,由泵输送的流动相冲洗定量环,推动样品进入液相分析柱进行分析。
虽然六通阀进样器具有结构简单、使用方便、寿命长、日常无需维修等特点,但正确的使用和维护将能增加使用寿命,保护周边设备,同时增加分析准确度。如使用得当的话,六通阀进样器一般可连续进样3万次而无需维修。

以下浅谈有关六通阀进样器的使用及保养事宜(仅供参考):
1、手柄处于Load和Inject之间时,由于暂时堵住了流路,流路中压力骤增,再转到进样位,过高的压力在柱头上引起损坏,所以应尽快转动阀,不能停留在中途。在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱,是平头注射器。一方面,针头外侧紧贴进样器密封管内侧,密封性能好,不漏液,不引入空气;另一方面,也防止了针头刺坏密封组件及定子。
2、六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。使用部分装液法进样时,进样量最多为定量环体积的75%,如20gL的定量环最多进样15p,L的样品,并且要求每次进样体积准确、相同;使用完全装液法进样时,进样量最少为定量环体积的3至5倍,即20gL的定量环最少进样60至1001aL的样品,这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液,达到所要求的精密度及重现性。推荐采用100ul的平头进样针配合20ul满环进样。
3、可根据进样体积的需要自已制作定量环,一般不要求精确计算定量环的体积,譬如,一根名义上10gL的定量环,实际是9gL还是1lgL并不重要,因为被测样品和校正样品的进样体积保持一致,在计算结果时误差都被抵消了。
4、进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质,样品溶液均要用0.45~tm的滤膜过滤。防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中,每次结束后应冲洗进样器,通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗,在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗,再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧。
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xingyi08[使用道具]
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色谱柱的维护


更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片(同时可以修补色谱柱)

注意:在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前,应该将色谱柱充分用水和甲醇/乙腈冲洗,而且修补工具的头部也应该蘸取少量的甲醇/乙腈,以避免在取出滤网和玻璃棉滤片时带出柱子内的填料。
1.将修补工具中的2套入柱芯的顶端
2.将修补工具中的3轻轻地旋入已套着2的柱芯中,并顺时针方向旋转到旋紧
3.一手握柱芯,另一只手轻轻地向外拉3,取出柱芯顶端的滤网
4.用一个小铲子轻轻地取出滤网下面的玻璃棉以及被污染的填料
5.将新的填料用甲醇润湿,然后填入挖去的部位,压平
6.照(左图)装上新的玻璃棉滤网,并用修补工具中的4将玻璃棉压入柱芯顶端
7.柱芯顶端套上2,然后参照(左图)将滤网放入
8.压紧,然后取下2,再用4将滤网的边缘压平

平衡色谱柱  反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉,因此在用流动相分析样品之前,应使用10-20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱;如果您所使用的流动相中含有缓冲盐,应注意用纯水"过渡"。
  硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相,请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡

如何平衡色谱柱?
  平衡过程中,将流速缓慢地提高
  用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线(缓冲盐或离子对试剂度如果较低,则需要较长的时间来平衡)


色谱柱的再生   进行色谱柱再生时,应使用一个谦价的泵,我们建议最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵。

表1 建议用来冲洗的溶剂体积
色谱柱尺寸 柱体积 所用溶剂的体积
125-4 1.6ml 30ml
250-4 3.2ml 60ml
250-10 -20ml 400ml
请根据下表选择您的再生方法:
极性固定相(如Si,NH2*,DIOL基色谱填料)的再生:
正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**
非极性固定相(如反相色谱填料RP-18,RP-8,CN等)的再生:
水→乙腈→氯仿(或异丙醇)→乙腈→水
0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱

注意:
在对NH2改性的色谱柱进行再生时,由于NH2可能成铵根离子的形式存在,因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗,然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。
**如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质,用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。

色谱柱的维护
1.使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度)
2.大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2-7.5,尽量不超过该色谱柱的pH范围
3.避免流动相组成及极性的剧烈变化
4.流动相使用前必须经脱气和过滤处理
5.如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相,应在实验完毕柱子冲洗干净,并保存大乙腈中
6.压力升高是需要更换预柱的信号
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mimili_901[使用道具]
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woshituzhu[使用道具]
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想请教一个问题,哪个同时使用过进口的HPLC/GC和国产的,进口仪器和国产的到底在哪些方面存在着差异。能否详细一点的说一下?我们想买国产的仪器(因为便宜的多),但是又担心买回来后使用会带来很多问题。
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二子[使用道具]
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小弟在做elsd,高手说发些使用方法和注意事项啊,用的是法国SEDEX75
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gogo[使用道具]
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楼主,分析学的这么透,如何做到的呀,我做了很长时间液相了,连如何解释“理论塔板数”都不清晰
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进液处的沙芯过滤头要怎么清洗啊?
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