蛋白质与蛋白组学

1. TCA/丙酮法：

（1）取4g果肉，用液氮在研钵中将其研磨成粉。

（2）加入12.5%冰冷的TCA/丙酮（含0.07%β-巯基乙醇），匀浆液在-20 ºC下放置3h，纱布过滤。

（3）滤液在20000g离心30min，收集沉淀。

（4）用冷丙酮洗3次，沉淀在4ºC下干燥，备用。

[ 本帖最后由 Neo 于 2007-11-12 22:32 编辑 ]

2. 匀浆法：

（1）称取4g果肉，用液氮在研钵中研磨成粉。

（2）加入4ml的匀浆缓冲液(匀浆液中含有20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM sucrose, 10 mM EGTA, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 以及1% Triton X-100)，继续研磨。

（3）匀浆液20000g离心30min。

（4）将上清转移到新的离心管中，加入终浓度为10%TCA溶液，4ºC下放置2 h。

（5）20000g离心40min，收集沉淀。

（6）用冷丙酮洗3次，沉淀在4ºC下干燥，备用。

[ 本帖最后由 Neo 于 2007-11-12 22:33 编辑 ]

3. 酚提取法：

（1）称取4g果肉，用液氮在研钵中研磨成粉。


（2）加入4ml的匀浆缓冲液(匀浆液中含有20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM sucrose, 10 mM EGTA, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 以及1% Triton X-100)，继续研磨。

（3）匀浆液20000g离心30min。

（4）在上清液中加入等体积的pH7.8 Tris-饱和酚，充分摇荡，混匀，10000g，4ºC下离心30min，上层为水相，中间白色物质为杂质，下层为酚相。（注：当提高匀浆缓冲液中sucrose的浓度到1M时，酚相会出现在上层。）

（5）回收酚相，加入5倍体积含0.1M   乙酸铵的预冷甲醇，充分混匀，-20ºC下过夜，沉淀蛋白。


（6）沉淀用含0.1M    乙酸铵的预冷甲醇洗2次。预冷丙酮洗2次。

（7）沉淀在4ºC下干燥，备用。

参考文献：

Saravanan R S, Rose J K C. 2004. A critical evaluation of sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of recalcitrant plant tissues. Proteomics, 4: 2522-2532.

Shen S H, Jing Y X, Kuang T Y. 2003a. Proteomics approach to identify wound-response related proteins from rice leaf sheath. Proteomics, 3: 527-535.、

Shen S H, Sharma A, Komatsu S. 2003b. Characterization of proteins responsive to Gibberellin in the leaf-sheath of rice Oryza sativa L seedling using proteome analysis. Biol Pharm Bull, 26: 129-136.

Chan, Z.L., Qin, G.Z., Xu, X.B., Li, B.Q., and Tian, S.P. 2007. Proteome approach to characterize proteins induced by antagonist yeast and salicylic acid in peach fruit. J. Proteome Res. 6: 1677-1688.

谢谢楼上的。

不过有时候沉淀不好溶解，用裂解液溶解的也不完全！

不要过于干燥。蛋白粉末中丙酮差不多挥发干净就可以。否则很难溶解。

Tris-饱和酚和水饱和酚的提取方法一样吗?

Tris-饱和酚提取时酚相在下层，那水饱和酚提取时酚相在上层还是在下层?

呵呵，没用过水饱和酚。不建议使用。

以上三种方法会让蛋白变性吗？谢谢

呵呵，应该不会。