[分享]Caco-2细胞培养的一点重要经验

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标题:[分享]Caco-2细胞培养的一点重要经验

四福晋[使用道具]
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发表于 2011-12-1 15:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

[分享]Caco-2细胞培养的一点重要经验（转载）

这个细胞对生长环境的要求非常之高。除了大家熟知的培养液条件的苛刻外（此不详述，又不懂的可留言问），对生长的空间问题要求比较高。

在每一次传代消化的时候，要消化足够长的时间，要不停地在镜下观察细胞的消化状态。因为这个细胞长的比较厚，所以消化比较困难。需要耐心。而消化的结果应该是保证足够多的细胞都是成单个状态而不是抱团或者成片。对于这一点，常规消化是比较难做到的。所以需要采取点特殊措施，我一般是这样做的：

首先吸干净原培养基，加入PBS洗，至少洗两遍，第二遍可以时间长一点，起到一定浸润作用，然后吸走，加入少量含EDTA的胰酶（以下简称YE）润洗，快速润洗完细胞生长面后吸走，然后加入适量的YE（我个人一般较常用量多加0.5-1ml），进行充分的消化，保持在镜下适时观察。待较多细胞被消化下来悬浮于消化液中，大部分细胞边缘皱缩变清晰后，用吸管吸出消化液入离心管中加入适量培养基，常规离心5分钟左右，离心完毕倾倒上清，加入新鲜培养基吹打均匀，然后置于新的小培养瓶中培养。原培养瓶中加入培养基吹打，细胞吹下来之后，适当多吹打几次细胞悬液以使细胞单个分离均匀。然后分瓶传代，原瓶加入新培养基继续培养。

很关键的一点就是将YE的消化细胞悬液加培养基离心后培养，因为这里面的细胞基本上都是被消化下来的单个单个细胞，Caco-2细胞单个单个的生长会比抱团的生长的好很多。传入新的培养瓶中之后你可以与原瓶进行比较。当然若细胞消化的好的话，这点可以舍弃掉。

提醒;一定要用好的胰酶！这点钱一定得花！

希望对大家有用。

园丁##[使用道具]
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发表于 2011-12-1 15:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不错不错,可惜我现在不做这个细胞了,想当年做得时候那叫一个痛苦啊.怎么养都养不好,总是一片片的细胞消化时.不过还是谢谢楼主的分享哦,敢问楼主养这个细胞是做什么呢,轮状病毒?

四福晋[使用道具]
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发表于 2011-12-1 15:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #2 园丁## 的帖子

不是，我是做转运体的。呵呵。。现在基本摸清门道了，觉得还好了，不好养是不好养，现在养到门路了，觉得还是蛮好养的呢。。。

dotaaa[使用道具]
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发表于 2011-12-1 15:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢楼主的好经验分享，我们正好也在培养Caco-2细胞，具体是建立一个模拟肠壁渗透的模型，在体外对药物的吸收做一个大致的评估（In vitro permeability study).
关于Caco-2的培养基，我来补充点儿实在的：
-DMEM with 10%FBS, 10mM HEPES, 1% Non-essential amino acids and 2mM L-glutamine.
*DMEM Medium(powder):
GIBCO,Cat No.:12100-046
*HEPES(powder):
SIGMA,Cat No.:H-4034
*Non-essential amino acids:
GIBCO,Cat No.:1140-050
希望对准备养Caco-2的战友有帮助，而且耐心真的很重要．

windy+++[使用道具]
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发表于 2011-12-1 15:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不错，对很多肿瘤细胞的培养都管用。

白白的[使用道具]
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发表于 2011-12-1 15:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

关键是血清的问题，若用进口的，进行培养还是挺简单的，我门主要使用进行酶的提取，传代时，在显微镜的帮助下，多消化几次，即可。

@STAR@[使用道具]
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发表于 2011-12-1 15:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

能否上传一张照片看看啊！？我的细胞铺到transwell里头，21day， TEER只有500多！再继续培养也涨不了多少。。。郁闷啊！是不是细胞不行！？

园丁##[使用道具]
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发表于 2011-12-1 15:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #7 @STAR@ 的帖子

因为不知道你们具体的做法，如果２１天ＴＥＥＲ只有５００多，那细胞出问题的机会比较大．可能是细胞长的太慢，没有铺满（seed cell的数量？）；或者细胞长的不够好，根本形成不了一块儿地毡．
以下是我们用的Procedure，希望有帮助．
Seeding of 24-well culture insert(day1)
*Pre-incubation of the BD transwell culture system:add 200ul of complete DMEM in each insert and 1ml in each well of 24-well plate.Incubate for 2hours at 37℃.
*Measure TEER in blank inserts before seeding.
*Seed 6x10^4 cells/cm^2 (2x10^4 cells/well) to each insert(in triplicate).
*Incubate the transwell culture system in the 37℃ CO2 incubator.
*Change medium for the transwell culture system every other day contiunously for 21-25days.

Remark:
(1)BD BioCoat (Cat No.354803)
Fibrillar collagen TypeI Insert System 24-Multiwell Insert Plate 1.0 Micron.
(2)MILLPORE
MILLICELL-ERS (Cat No.MERS00001)

补充：我查了实验记录，day1空白的TEER是１００多，day21时大部分的TEER已经达到２０００左右了．

给你做个参考，有问题大家在一起讨论．

盼盼[使用道具]
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发表于 2011-12-1 15:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请大家帮忙：如果transwell没有铺基质胶，可否用多聚赖氨酸（爬片时为细胞更好的粘附到片子时用的）代替Matrigel？

caihong[使用道具]
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发表于 2011-12-1 15:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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