细胞世界

战友您好！非常欢迎您参加讨论！
首先，此试验的生物学原理目前还不是很清楚，Sighn和Olive这两个单细胞凝胶电泳的鼻祖首先提出的中性和碱性条件，中性条件检测双链断裂，而碱性条件检测单链断裂，有人曾提出这是为什么，我查阅了大量文献，国外文献没有具体的说明，国内文献更是人云亦云，所以，目前只能按照大家比较默认的：中性－－双链，碱性－－单链，这不是用软件来区分的，而是你的试验条件决定的，我看了您的裂解液ph10，所以检测结果应是单链断裂。
其次，您用的是三层三明治铺胶法，目前多数彗星试验已经少用此法，而是双层法甚至单层灌胶，有人担心双层或单层铺胶的脱胶问题，只要在凝胶的承载载体上做点文章，就解决了！我用的是双层铺胶法，我不知道您的第一层正常熔点胶为什么要烤干，是为了防治脱胶吗？我建议您采用双层法（卖瓜人不说自己的瓜苦，呵呵），这样在实验操作上可以节省时间，不必担心脱胶问题，我做了一年多了，自认为很成熟了，从来没有出现脱胶问题，（我不知道您用的凝胶承载体是什么？）。
第三，解旋20分钟应该没问题，但是我认为您的电泳时间过长，当然我不知道您的电泳条件（电压、电流、），我认为20分钟足够了，时间长了一是浪费时间，二是彗星图像不好，不利于分析。
第四，因为我用的EB染色，2ug/ml，效果很好，您用PI染色，我可能没有发言权，因为我不知道PI 的荧光激发光波长是多少，是否您的荧光条件不对？可以查查文献，这一点您对PI应该比我更了解吧。
第五，您的裂解时间有点短了，文献报道，最好不要少于1.5小时。
第六，我不知道您用的什么细胞，50000个细胞加入100ul0.5％低熔点胶，是不是细胞太多了，含细胞层的凝胶如果细胞密度过大，即使做出结果，彗星图像过于密集，头尾连接互相影响，无法分析。一般100ul0.5％低熔点胶中含400个细胞就足够了。

还有一点，差点忘了，我刚刚做的时候，不会用荧光显微镜，大开了自然光源，其实荧光激发根本不用开自然光源，画蛇添足。
只要荧光光路通畅了，物镜会出现特殊的荧光，只要波片上有荧光染色的细胞，它肯定跑不了！
另外，我不知道您用什么软件分析彗星图像，我用CASP，很好用，如果需要，我可以提供连接，网上可以下载的。
本版【图片仓库】子版有我做的彗星图像，感兴趣可以看看
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2729243&sty=1&tpg=1&age=0')
如有什么问题或我的回答有不妥之处，敬请指正。

非常感谢 一叶 老师，您的建议很有用。
1.我用的是HepG2细胞，我是看了一篇文献，上面说最大可以达到50000个细胞，因为第一次做的时候一个细胞都没见到，我以为是细胞数过少，所以我就加大细胞：（ 根据您的指导，应该肯定可以排除这个可能性了。
2.关于电泳时间，我也是参考文献的，同时该篇文献上建议的电泳条件为 15V 400mA,但我们实验室的电泳仪电流上不去，只能到100mA，不过参照您的成功经验，这样的条件已经是可以了的 吧？
3.我烤胶也是按照同一篇文献的：（ 主要也是为了防止脱胶的问题。因为我开始也试过不烤胶，裂解后捞起来时确实出现了脱胶的问题，所以还得向您请教一下，每层胶铺上以后时怎么处理的？另外，我用的载体是普通的显微镜观察用的载玻片，不知道行不行？
4.关于染色的问题，由于我们实验室这个实验做的不多，所以不敢用EB，怕污染了荧光显微镜，根据文献建议的几种燃料，我选择了PI，不过我现在想可能是浓度小了，昨天我上流式用PI单染时，用到了1mg/ml出来结果很漂亮，下面我也会考虑加到PI浓度试一下。不过也可能正如您的提示，我的裂解时间过短，我会首先拉长裂解时间看看的。另外，我配的各种溶液成分是对的吧？
5.关于单链，双链断裂的问题，因为我正是想通过这个实验看看我的样品对DNA的损伤情况，或者是说究竟有无损伤？（不知道我这要设计合不合理？敬请指正）如果这样可以的话，是不是我要分别做中性和碱性的实验，再进行判断？
6.我观察细胞的时候是把自然光关掉的，所以应该不是这个问题。关于数据分析的问题，是不是我用数码相机拍下了照片就可用CASP了？如果是就太好了，因为我正想去外边联系成像系统和分析软件呢。所以还麻烦您提供下载的链接。
再次感谢 一叶 老师，希望您能继续指导我的实验。

SCGE的实验条件尚缺乏标准化，去年曾在美国召开专门会议讨论SCGE的标准化，这都是有文献可查的。
您的列解液应该不是问题，只要能够把细胞膜和核膜列解就可以了，1%TritonX-100 应该是临用时加的吧，另外我还加了DMSO，也是临用时加的。
我觉得您完全可以作中性和碱性两种，这样您的结果就更完美了。
三层铺胶法在铺胶后都要加盖片的，目的是使胶平整，凝胶固化后移去盖片，再铺另一层，普通波片表面比较光滑，容易脱胶，文献多用毛玻璃片，应该好一点，但也不能完全避免脱胶，我是将普通波片稍加改良，在波片上人为作出两个小电泳槽，是用很窄的玻璃条封上的，这就看你的功夫了，不过这可是一劳永逸的事，不会脱胶。
作出的彗星图像用数码相机拍摄后转入计算机，然后就可以用CASP了，我想你的数码相机已经准备好了吧，我用的是NIKON 4500，可以和荧光显微镜配套的。注意，CASP只读.tif扩展名的图像，如果你的相机拍摄的图像可以有.tif格式，就更好了，如果是.jpg格式，那还要在计算机中转换一下，不过很简单。目前国外有很多SCGE的自动成像分析系统，不过，价格也不菲，还是自己用相机拍的好。
另外，我还是为你担心一个问题，100ul胶含50000个细胞，出来的彗星图像可能密度太大，每个图像都互相影响，将来无法用CASP分析，除非您的胶铺的很薄，不过，就我 的经验，不会很薄吧。
下面就是CASP的链接，可以免费下载，使用也很简单，看看说明就可以了，祝你成功！

cuturl('http://sourceforge.net/project/showfiles.php?group_id=91972')

感谢 一叶 老师的指点，我会把细胞数降下来的，我先做一下，有问题再向您请教。