浅谈细胞实验污染那些事儿

细胞生物学是药物研发的新方法和新技术之一,其是以细胞作为生命活动的基本单位的思想为出发点,在细胞、细胞超微结构和分子水平等不同层次上探索生命活力基本规律的基础学科,细胞生物实验服务常常会包含在一些医药研发提供的服务项目之中。在细胞生物实验过程中常常会碰到污染,这些污染决定着细胞实验的成败。细胞污染常见的类型有细菌污染、真菌污染、支原体和病毒污染。

美迪西提供生物实验服务,其在分子生物学、细胞生物学、体外生物学和结构生物学领域有丰富的经验,可以从最初的cDNA文库构建到药物设计,通过蛋白质纯化、结构测定和分析测定,提供一套完整的生物技术服务流程。

1、细菌污染

细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染,即使在细胞培养液中加入了抗菌素,也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌,如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌,其中又以白色葡萄球菌较常见。培养细胞受细菌污染后,会出现培养液变混浊、pH改变。污染后细胞发生病理改变,胞内颗粒增多、增粗,最后变圆脱落死亡。

2、真菌污染

真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种,最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。

  培养细胞受真菌污染后,可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点,有的散在生长,培养液一般不发生混浊;倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中,有的呈链状排列。真菌污染后,细胞生长变慢,但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。

鉴别细胞是细菌还是真菌污染,首先可以通过肉眼观察,细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生,而且增生迅速,若有污染,在48小时内可明显观察到,例如培养液变混浊,或略加振荡有很多漂浮物漂起;其次可以通过接种观察,采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种,也可发现是否有污染;此外在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮,即为细菌污染,若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。

3、支原体污染

支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物,最小直径0.2μm,一般过滤除菌无法去除它,光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现,能在偏碱条件下生存,对青霉素有抗药性,多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。

培养细胞受支原体污染后,部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢,部分细胞变圆,从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化,或略有变化,若不及时处理,还会产生交叉污染。支原体污染的检测可以通过相差显微镜观察、荧光染色法观察、电镜检测和培养检测4种方法。

4、病毒污染

  组织细胞培养过程中,如果没有除去潜在的病毒,就会产生病毒污染。目前,从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。

  尽管病毒污染的细胞不影响原代培养,但生产疫苗是不安全的。因此,潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。病毒污染的检测可以应用电镜技术快速诊断动物病毒病或运用逆转录_聚合酶链反应(RT_PCR)检测病毒。

5、非同种细胞污染

  由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开,往往会使一种细胞被另一种细胞污染。目前,世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染,致使许多实验宣告无效。

  非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生,大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。

导致细胞污染的四大原因

(1)培养箱太久没清洁培养箱太久没清洁

细胞污染了,并不是直接扔了污染的培养皿就行了,首先得检查这个恒温培养箱里其他培养皿或孔板里的细胞是否污染,如果有而且好几个板子都有类似的污染块,那很可能是培养箱中的水或者空气污染了,得给培养箱做个大扫除,重新酒精消毒,照紫外;孵箱里的水没了的话得加上,托盘得常用酒精消毒。

(2)超净台和桌面,东西太多太乱

超净台要保持干净整洁,储物箱、培养皿、各种规格的板子、枪头就不要堆在超净台上。细胞房其他的桌面,同样切忌东西堆积如山,不要将酒精棉球、标签纸、牛皮纸买来后全部堆在细胞房!一不小心“飘”进细胞培养板里,细胞就会受到污染。

(3)细胞房人多口杂,难管理

细胞房这种卫生要求高,人多的话,不确定因素就多了,难以保证试验在无菌条件下操作。出入试验室,要穿好实验服,戴上鞋套;超净台做实验时,要戴上口罩。

(4)违规操作

为节省时间,有人已经用超净台四个多小时,不开紫外灭菌30min,酒精擦拭后直接开始试验;器材或者溶液很久没有,未检测是否污染直接使用;离心管多次使用,抢头为图方便交叉使用;超净台不点酒精灯或点了酒精灯放在右上角,而在左下角做试验不带手套,徒手操作。