荧光强度分析法可应用于高通量药物筛选

20世纪80年代发展起来的高通量药物筛选技术是新药发现过程中的主要技术手段,高通量药物筛选模型可以在同一时间内对数以千、万计的样品进行检测,并以相应的数据库支持整个技术体系的正常运转。快速灵敏的检测仪器采集试验结果数据是高通量药物筛选的特点之一,由于筛选试验是在微量条件下完成的,因此就需要高灵敏度的检测仪器。目前,用于高通量药物筛选的仪器种类很多,其最大的特点是可以对各种不同规格微板中的样品直接进行测定,如荧光测定法、化学发光测定、生物发光测定等。

荧光强度分析法可以依据荧光强度的变化进行检测,如荧光生成检测法中反应后荧光强度增加;在荧光淬灭检测法中,荧光强度减弱。该方法操作简便,适于微量化。分别有研究者利用荧光强度分析法建立了高通量的流感病毒神经氨酸酶(NA)抑制剂药物筛选模型和调节一氧化氮合酶(NOS)活性的药物筛选模型。在荧光强度高通量药物筛选方法中,需要测定总的荧光强度,筛选化合物的自身荧光和猝灭效应可能会干扰测定结果,在最后的计算中可以作为异常数据除去,达到提高筛选精确性的目的。

药物筛选是寻找新药的重要途径,建立相应的药物筛选模型是药物筛选的关键环节。美迪西在抗肿瘤、免疫性疾病、抗炎、心血管疾病、镇痛和糖尿病等研究领域建立了相对成熟的药物筛选模型,提供药物筛选服务。

1、荧光强度分析法在流感病毒NA抑制剂高通量筛选研究

神经氨酸酶有唾液酸酶活性,在甲、乙型流感病毒的复制、感染和致病过程中起着重要作用。抑制流感病毒的神经氨酸酶活性可以有效地控制甲、乙型流感病毒感染引起的流感症状和疾病的传播。因此有研究者建立适用于高通量筛选的流感病毒NA抑制剂筛选模型。

研究者从甲型及乙型流感病毒中制备神经氨酸酶,以2-(4-methylumbelliferyl)-α-D-N-acetylneuraminicacid(MUNANA)作为底物,建立检测神经氨酸酶活性的荧光测定法及其抑制剂体外筛选方法,用高通量筛选系统对1200个化合物与提取物进行初筛。结果神经氨酸酶酶促反应以pH3.5,二价阳离子浓度为26mmol*L-137℃孵育时酶活性最佳;甲、乙型流感病毒不同株神经氨酸酶的米氏常数(Km)的范围为(4.895.94)μmol*L-1;初筛发现12个化合物对流感病毒神经氨酸酶有可重复的抑制活性。

该研究优化了神经氨酸酶反应体系,建立的体外模型可用于抗甲、乙型流感病毒药物的高通量筛选及酶抑制动力学的研究。

2、荧光强度分析法在筛选调节NOS活性的药物上的研究

一氧化氮是生物体内的重要活性物质,在适当情况下增加或减少NO的生产对于脑组织病变的恢复和脑细胞损伤减轻有重要作用。一氧化氮合酶NO合成的关键催化酶,为了寻找作用于中枢神经系统NOS的化合物研究促进和抑制NOS活性的药物,有研究者利用荧光检测的方法建立了建立NOS活性的高通量药物筛选模型。

为了筛选调节NOS活性的药物,方法通过NADPH荧光值的变化,间接反映NOS活性。生物体内的NOS催化产生NO的反应需要NADPH作为辅助因子,在产生NO的同时伴随着NADPHNADP+的转化,使反应体系中的NADPH浓度降低。NADPH350nm波长的激发光照射下,产生波长450nm的荧光。反应体系中荧光值的降低速率可以反应NADPH含量变化,因而可以间接反应NOS的活性。通过对反应体系的优化,调整各反应底物(NADPHL-ArgNOS)及抑制剂(L-NNA)的浓度,建立高通量筛选模型并对5600个样品进行筛选

结果该方法简便、容易操作、灵敏度高、结果稳定,发现了一批对NOS具有抑制或增强作用的化合物,因此此法适用于高通量药物筛选。

以NA为抗流感药物的作用靶点,建立可以用于高通量药物筛选的模型,筛选NA抑制剂,有利于研发抗流感新药。而建立的影响NOS活性的高通量药物筛选模型是适用于大规模筛选微量反应体系的筛选模型,试验过程简便、操作方便且灵敏度高。

高通量药物筛选模型的基本特点是可以对大量样品的随机筛选,这种方式正是发现创新药物的基本要求,因此,高通量药物筛选也就成为发现新药、开发创新药物的主要方式之一。