[讨论帖]“黑胶虫”问题

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标题:[讨论帖]“黑胶虫”问题

vvmmoy[使用道具]
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发表于 2011-12-8 15:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

[讨论帖]“黑胶虫”问题（转载）

有关细胞技术的热门话题——“黑胶虫”问题

1.我们实验室最近一次的情况:
我们前后从上海细胞中心买了三批细胞，细胞刚到的时候，观察均生长良好，密度适中，培养液清亮，也没有见小黑点，但是对细胞传代以后就陆续出现多少不等的小黑点，有时候在一夜之间暴长，给培养液加庆大霉素，也无济于事，对贴壁细胞用生理盐水及D-hanks液冲洗七遍后见减少，但是随后几天又出现，刚开始怀疑操作有问题，但是由有经验的老师操作也出现这种问题，陆续对培养液，血清及胰酶进行培养也没发现问题。
同时培养箱也有本实验室保存的3t3细胞进行培养，生长快，很快铺满，仔细观察也可以见到少量的黑点。
后来还有从军科院过来的Hela细胞，没有使用我们的血清，直接吸出多余的培养液后，进行培养，传代后用原来吸出的培养液进行培养，同样发现了问题。
可以发现如下的特点：
（1）  与细胞共生，细胞长的好或密度大的话，小黑点就少，反之则多；
（2）  对抗生素无效；
（3）  可能通过培养箱空气进行污染；
（4）  单用培养液及血清培养没发现问题。
（5）  换掖冲洗后也无效。

以下是论坛里我找来的相关帖子内容
“黑胶虫”是近十几年才发现的一种细胞污染物，“黑胶虫”的分类目前尚无鉴定确认。
“黑胶虫”可寄生于动物细胞，也可以生存于培养基中，依靠细胞和培养基中的营养为生，并随细胞传代而传代。“黑胶虫”与细胞竞争性生长，开始时对细胞并没有什么影响，但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候，细胞生长就会受到影响直至死亡，严重影响了科研活动的开展和进行。所以“黑胶虫”的污染常在培养条件改变、细胞接种密度降低、细胞状态不佳时显现并使实验中断，尤其在冻存细胞复苏时可造成大量细胞死亡。
目前比较公认的观点认为“黑胶虫”是一种微生物，增殖缓慢但对细胞有损害，数量达到一定程度可引起细胞死亡，其来源可能是细胞本身的污染或从动物取材时污染造成的。该污染在全世界细胞实验室中普遍存在，解决该问题是一个世界性难题
关于是什么的问题的讨论
A.  玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西（曾经有文献报道过）
B.  据说这是黑胶虫，又有人说是原生动物，好象也没个统一的说法
C.  据病毒所和军科院鉴定是一种寄生于牛血清内的一种原虫，似乎和草履虫和变形虫有类似之处，然而由于课题经费不够而不能继续进行下去。
D.  有人说是纳米级的细菌

其他的特点
（1）形态上有些像细菌，直径约在0.5~1微米，
（2）在400X倒置显微镜小，有典型的布朗运动（不规则的原地小距离抖动）。
（3）细胞内好像也有存在，
（4）但并不引起培养液混浊
（5）时间稍长，细胞状态明显恶化，并最后死亡

大家的处理：
1.换好一点的血清（我觉着和血清的关系不大）。
2.如果是贴壁细胞的话，可用无菌的PBS洗几次，可一定程度上缓解。若是悬浮的话，就不太好处理拉，可以向其中少加一点滋养细胞（从小鼠腹腔内取的巨噬细胞，这种细胞不分裂，过一阵就死掉了，做抗体杂交瘤融合的同志肯定知道）。加滋养细胞对有黑胶虫的刚复苏的细胞很有效！还有就是实验环境要注意好，保持细胞间整个环境的洁净度。
3.换用进口的一次性塑料培养瓶。
4.建议清理无菌室所有物品，重新灭菌，用KMnO4熏蒸，按首次使用无菌室做，细胞重新复苏，。
5. 在换液前先加入生理盐水并轻轻拍打，冲洗干净后再加入培养液，坚持天天洗，传代时加生理盐水再离心一次，接种密度稍大一些，一段时间后，虫子就会大大减少，对细胞的生长也不会有大的影响。
6.有材料称minocycline具有一定的作用，可以和换液结合起来使用。

彼岸花opp[使用道具]
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发表于 2011-12-8 15:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近培养的Hela细胞，经住了考验，小黑点变的细碎，也不在动了，但是还有一个细胞株仍然存在问题！附上照片，10×20

附件

2011-12-8 15:28

42887468.jpg (13.85 KB)

园丁##[使用道具]
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发表于 2011-12-8 15:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

杀黑胶虫培养基在这里有卖 , 中国医学科学院肿瘤研究所肿瘤生物学检测中心cuturl('http://www.cicams.ac.cn/marker/service.htm')

中国特色[使用道具]
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发表于 2011-12-8 15:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很难根除。

最好的办法就是舍弃并进行全面的熏蒸杀菌

我们实验室也污染了一次，后来熏蒸了一个星期，换气也用了1个星期，后来就好了，期间我也用什么换血清等方法弄过，不过作用不大，过几天那个又多了。呵呵

还是彻底的消毒一次好啊。

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发表于 2011-12-8 15:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我近期培养的细胞中也发现类似的东西, 不知是不是黑胶虫污染, 曾经将其涂片及细菌接种均没发现细菌, 但我的细胞状态不好, 有较多碎片.

请教对实验室全面消毒必须用熏蒸吗?我用新洁尔灭擦洗后再用紫外线照射不可吗? 实验进展严重受阻了.

duoduo[使用道具]
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发表于 2011-12-8 15:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你怎么知道它不是支原体污染呢？应该首先进行支原体的检测。黑胶虫之说很难让人信服。

pengke1983[使用道具]
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发表于 2011-12-8 15:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的细胞也遭此大难，状态不好，看了感觉很有帮助，谢谢！

DNA[使用道具]
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发表于 2011-12-8 15:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

同感同感！我们试验室的细胞全面染菌，像极了“黑胶虫”，这家伙很顽固，那都有，我们都无从下手了，上面说过它的直径是0.5-1微米的话，用0.22的滤膜应该能滤掉呀，我在刚买的血清空培养中发现了它，现在根本不敢复苏细胞，快疯掉了

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发表于 2011-12-8 15:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位战友:
我是进行海马神经元培养的,也发现在培养的后期开始出现黑色点点,而且不像是死细胞,应为是成大片状,根据上面所描述的有可能是黑胶虫感染,想问问是不是与培养箱污染也是有关的?经常打扫培养箱能根除吗?

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发表于 2011-12-8 15:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

啊！我们实验室也遭过的！但是同一个培养箱里有的有，有的没有，不知道怎么回事！

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