小中大关于细胞的接种(铺板)
细胞过了30代以后就不要用了,因为状态不好了;培养板要用好的(最好进口板),不好的板或重复利用的板只可做预实验。
接种时最好按照预实验摸索出的密度接种, 因为细胞密度在10000/ml左右时,所测得的OD值的区间即细胞抑制率(或者增值率)的所呈现的线性关系最好,结果最可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显,太密细胞可能都会凋亡,因为细胞长的太快营养会不够,最后导致死亡。且而细胞过密或者过少,增殖都会过快或者过慢,其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用10000/ml,100ul/孔。
细胞密度要根据不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度,如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度,这样与对照的区别更明显,数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103-104.
其它的声音:
1.首先细胞的接种密度一定不能过大,一般每孔1000个左右就够了,我认为宁少勿多。尤其是对于肿瘤细胞。10000/孔是太高了,这样即使药物有作用,MTT方法也是表现不出的,最佳点板浓度在4000-5000/孔,太少的话SD值会很大。
2.MTT本身就是比较粗的实验,增殖率10%左右的波动都不算奇怪。特别是新手,20%的波动也是常见的,所以很可能是技术原因引起的,特别是种板技术一定要过关。
3.我做的是肿瘤细胞的MTT实验,这种细胞长的很快一开始我是用100000/ML的浓度来接种的,结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系.后来调整浓度,用过40000~80000/ML的浓度都做过MTT实验,结果发现做的结果比较好点的是60000~70000/ML的浓度组的.用40000/M的浓度的组,由于细胞少,药物作用的梯度还是有,只是没有很好的线性关系.还有根据细胞生长速度以及药物的特性(有时间依赖性和浓度依赖性的药物)来确定培养时间是48小时还是72小时.
注意细胞悬液一定要混匀,已避免细胞沉淀下来,导致每孔中的细胞数量不等,可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练,尽量避免人为误差。虽然移液器比移液管精确得多,但是如果操作不熟,CV会在8%左右。另外,吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。
首先说说我的一点经验:
1.吹打时悬液总量不能太多,达到吸管吸液量的3到4倍,可能比较容易混匀。10ml的离心管里面最好装3~4ml的悬液:悬液太少容易吹起很多气泡,悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。。。
2.吸管的吸液量最好在1ml左右:吸液量过多的话,一下吸起很多液体,管中所剩就很少,这样吹打容易起泡,吸液量过少,吹打的力度就不够,吹打就会不均匀。如果是吸液量1ml多的吸管,总液量在5ml左右为益
3.吸的时候要在悬液底部,然后提起来一点,但是吹下去的时候不要离开液面,否则容易吹打出气泡。
4.吹打次数100左右,就可以吹打均匀了(有人认为加细胞前吹打30-50次基本就差不多均匀了。加细胞的时候每接种2孔反复吹打3次,每吹打3次后枪头垂悬与细胞悬液中5秒钟,然后再以一定的速度吸取悬液。)
5.向每孔中用枪头加入细胞时不要太快,否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆,一般都在孔的底部中央,而周边很少,这种不均匀的分散会产生接触抑制,影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。我习惯每块板加完后平握手中,向左3下,向右3下,在往返回复3下移动,目的是使得细胞能分散的均匀些。(铺板技术是MTT实验的关键,也是基础,一定要练好。曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞,最后细胞全死了,建议不要采用这种方法混匀细胞。